Caspase蛋白的種類、活化機制和檢測技巧
上期小優(yōu)細(xì)節(jié)君聊了下如何做好NRF2，沒想到反響還不錯，很多老師說對他們的實驗很有幫助。最近又碰到一個老師對Caspase很有興趣，Caspase相信大家都不陌生，凋亡劊子手、炎癥之友，但熟悉不一定好做，尤其是剪切體的Western。下面就讓我們一起看看細(xì)節(jié)君是如何見招拆招的。
細(xì)節(jié)君,老板讓我最近看看Caspase,你給我講講唄。
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，能夠特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的哺乳動物細(xì)胞Caspase家族成員共15種，他們有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性。
那這15種Caspase蛋白有什么區(qū)別？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：由于Caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡過程一旦觸發(fā)，即呈級聯(lián)放大效應(yīng)。根據(jù)Caspase在級聯(lián)反應(yīng)上、下游的位置及功能的不同，可分為三大類:
第1類為凋亡始動子,位于級聯(lián)反應(yīng)上游,包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等,該類蛋白酶的氨基端有一段特殊結(jié)構(gòu)域,如Caspase-2,-9上的CARD結(jié)構(gòu)和Caspase-8,-10上的DED結(jié)構(gòu),使其可與具備同源結(jié)構(gòu)的銜接蛋白結(jié)合并發(fā)生聚集, 進(jìn)而引發(fā)自身激活并激活下游的Caspase。
第2類為凋亡效應(yīng)子,位于級聯(lián)反應(yīng)下游,包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7,該類蛋白酶在受到起始凋亡蛋白酶的切割后被激活，活化后的效應(yīng)凋亡蛋白酶通過對維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生命活動所必須的蛋白進(jìn)行一一裂解,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞及DNA損傷斷裂，最終引起細(xì)胞死亡。
第3類包括Caspase-1、Caspase-4、Cas-pase-5、Caspase-11、Caspase-12,主要參與細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中起輔助作用。
你剛說的活化是什么意思呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：Caspase家族通常以無活性的蛋白酶原形式,酶原分子量在30-50 KD之間,由NH末端區(qū)、大亞基(P17-20)、小亞基(P10-12)及連接大小亞基的連接區(qū)組成。Caspase酶原分子激活后，大小亞基解離并重新組裝異源二聚體，再由兩個二聚體組成有活性的四聚體。
Caspase家族有這么多，我該如何開始做呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：建議可以先觀察Caspase-3的變化,Caspase-3在細(xì)胞凋亡中是關(guān)鍵的執(zhí)行者。Caspase-3一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免，對許多關(guān)鍵的蛋白起著部分或全部的裂解作用，如多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)及眾多細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白，因而Caspase-3也被稱為“YAMA”（閻羅王）。
那Caspase-3是如何活化的？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：正常情況下，細(xì)胞中的Caspase-3以無活性的酶原形式存在，細(xì)胞凋亡信號的出現(xiàn)可導(dǎo)致Caspase-3(32kDa)前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒祗w，成熟的Caspase-3由亞基p17(17kDa)和亞基p12(12kDa)組成。
Caspase-3前體的裂解位點為ESMD2S(氨基酸25-29)和IETD2S(氨基酸172-176)。Caspase-3從前體Caspase-3轉(zhuǎn)變成成熟Caspase-3分兩個步驟形成,首先在IETD2S位點被切割,產(chǎn)生p12亞基和20kDa(p20)肽,接著p20在ESMD2S位點被切割,產(chǎn)生成熟的p17亞基。
為什么有的組織檢測不到Caspase-3？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：Caspase-3 在一些組織中的蛋白表達(dá)較低，很難檢測到，例如大腦皮層，平滑肌，骨骼肌等。其實這個也可以理解，這個和每個組織本身的凋亡水平是密切相關(guān)的。
為什么western只能檢測到Caspase-3的前體，檢測不到剪切體呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：最關(guān)鍵的原因是凋亡誘導(dǎo)的成功與否。
如果是做經(jīng)典模型，要多參考文獻(xiàn)中的條件設(shè)置；
如果是探索性的實驗，務(wù)必要設(shè)置藥物誘導(dǎo)時間和濃度梯度的預(yù)實驗，來確定特定細(xì)胞系中誘導(dǎo)Caspase-3 活化的最佳條件。
如果不確定藥物是否可以誘導(dǎo)，強烈建議加入陽性對照，可以參考CST使用依托泊苷(25 uM for 5 hours)或十字孢堿(1uM for 3hours)處理的Jurkat、NIH/3T3細(xì)胞。
↓下圖是某位老師自己的樣本和處理方式與CST陽性對照的對比結(jié)果圖，也驗證了細(xì)胞系和誘導(dǎo)處理方式是做出Caspase-3剪切條帶的關(guān)鍵因素。
我做的是貼壁細(xì)胞，要不要收集上清中的細(xì)胞？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：細(xì)胞發(fā)生凋亡后會變得難貼壁，需離心收集所有的懸浮細(xì)胞。
其他western步驟還有沒有什么需要注意的呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：1. 裂解樣本的時候要超聲,使目的蛋白溶出更加充分,這點在做其他靶標(biāo)也是一樣的。
2. 保證足夠的蛋白上樣量,組織樣本推薦50~100μg,細(xì)胞樣本推薦20~50μg。
3. Caspase-3 剪切體分子量較少,注意轉(zhuǎn)膜時間不能太久,避免過度轉(zhuǎn)膜,同時膜要使用0.22μm。
我好不容易做出剪切體條帶了，但是趨勢不對，是什么原因呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：做的趨勢不對的時候，也別急著懷疑自己或者懷疑試劑的問題，可以順著現(xiàn)象去探索問題的本質(zhì)，很多出色的研究就是在“違背”我們所認(rèn)為的常理中發(fā)現(xiàn)的。
例如在癌癥治療中，細(xì)胞凋亡是一種公認(rèn)的細(xì)胞死亡機制，細(xì)胞毒性藥物通過它來殺死腫瘤細(xì)胞。但是在這篇研究中《Caspase 3-mediated stimulation of tumor cell repopulation during cancer radiotherapy》，作者發(fā)現(xiàn)快要死亡的腫瘤細(xì)胞利用凋亡過程中產(chǎn)生的強有力的生長刺激信號來重新生長，進(jìn)一步深入發(fā)現(xiàn)Caspase-3作為凋亡的執(zhí)行者，竟然還在生長刺激中起著關(guān)鍵作用。所以說，任何不尋常的可重復(fù)的可靠實驗結(jié)果都值得我們認(rèn)真對待。
怎么樣才能和小優(yōu)細(xì)節(jié)君保持聯(lián)系呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：電話：4008-168-068轉(zhuǎn)5，郵箱：techservice@univ-bio.com。
Caspase3相關(guān)產(chǎn)品
細(xì)節(jié)君,老板讓我最近看看Caspase,你給我講講唄。
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，能夠特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上的肽鍵�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的哺乳動物細(xì)胞Caspase家族成員共15種，他們有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性。
那這15種Caspase蛋白有什么區(qū)別？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：由于Caspase可自我活化并能相互激活，因此凋亡過程一旦觸發(fā)，即呈級聯(lián)放大效應(yīng)。根據(jù)Caspase在級聯(lián)反應(yīng)上、下游的位置及功能的不同，可分為三大類:
第1類為凋亡始動子,位于級聯(lián)反應(yīng)上游,包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等,該類蛋白酶的氨基端有一段特殊結(jié)構(gòu)域,如Caspase-2,-9上的CARD結(jié)構(gòu)和Caspase-8,-10上的DED結(jié)構(gòu),使其可與具備同源結(jié)構(gòu)的銜接蛋白結(jié)合并發(fā)生聚集, 進(jìn)而引發(fā)自身激活并激活下游的Caspase。
第2類為凋亡效應(yīng)子,位于級聯(lián)反應(yīng)下游,包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7,該類蛋白酶在受到起始凋亡蛋白酶的切割后被激活，活化后的效應(yīng)凋亡蛋白酶通過對維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生命活動所必須的蛋白進(jìn)行一一裂解,導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞及DNA損傷斷裂，最終引起細(xì)胞死亡。
第3類包括Caspase-1、Caspase-4、Cas-pase-5、Caspase-11、Caspase-12,主要參與細(xì)胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中起輔助作用。
你剛說的活化是什么意思呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：Caspase家族通常以無活性的蛋白酶原形式,酶原分子量在30-50 KD之間,由NH末端區(qū)、大亞基(P17-20)、小亞基(P10-12)及連接大小亞基的連接區(qū)組成。Caspase酶原分子激活后，大小亞基解離并重新組裝異源二聚體，再由兩個二聚體組成有活性的四聚體。
Caspase家族有這么多，我該如何開始做呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：建議可以先觀察Caspase-3的變化,Caspase-3在細(xì)胞凋亡中是關(guān)鍵的執(zhí)行者。Caspase-3一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免，對許多關(guān)鍵的蛋白起著部分或全部的裂解作用，如多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)及眾多細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白，因而Caspase-3也被稱為“YAMA”（閻羅王）。
那Caspase-3是如何活化的？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：正常情況下，細(xì)胞中的Caspase-3以無活性的酶原形式存在，細(xì)胞凋亡信號的出現(xiàn)可導(dǎo)致Caspase-3(32kDa)前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒祗w，成熟的Caspase-3由亞基p17(17kDa)和亞基p12(12kDa)組成。
Caspase-3前體的裂解位點為ESMD2S(氨基酸25-29)和IETD2S(氨基酸172-176)。Caspase-3從前體Caspase-3轉(zhuǎn)變成成熟Caspase-3分兩個步驟形成,首先在IETD2S位點被切割,產(chǎn)生p12亞基和20kDa(p20)肽,接著p20在ESMD2S位點被切割,產(chǎn)生成熟的p17亞基。
為什么有的組織檢測不到Caspase-3？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：Caspase-3 在一些組織中的蛋白表達(dá)較低，很難檢測到，例如大腦皮層，平滑肌，骨骼肌等。其實這個也可以理解，這個和每個組織本身的凋亡水平是密切相關(guān)的。
為什么western只能檢測到Caspase-3的前體，檢測不到剪切體呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：最關(guān)鍵的原因是凋亡誘導(dǎo)的成功與否。
如果是做經(jīng)典模型，要多參考文獻(xiàn)中的條件設(shè)置；
如果是探索性的實驗，務(wù)必要設(shè)置藥物誘導(dǎo)時間和濃度梯度的預(yù)實驗，來確定特定細(xì)胞系中誘導(dǎo)Caspase-3 活化的最佳條件。
如果不確定藥物是否可以誘導(dǎo)，強烈建議加入陽性對照，可以參考CST使用依托泊苷(25 uM for 5 hours)或十字孢堿(1uM for 3hours)處理的Jurkat、NIH/3T3細(xì)胞。
↓下圖是某位老師自己的樣本和處理方式與CST陽性對照的對比結(jié)果圖，也驗證了細(xì)胞系和誘導(dǎo)處理方式是做出Caspase-3剪切條帶的關(guān)鍵因素。
我做的是貼壁細(xì)胞，要不要收集上清中的細(xì)胞？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：細(xì)胞發(fā)生凋亡后會變得難貼壁，需離心收集所有的懸浮細(xì)胞。
其他western步驟還有沒有什么需要注意的呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：1. 裂解樣本的時候要超聲,使目的蛋白溶出更加充分,這點在做其他靶標(biāo)也是一樣的。
2. 保證足夠的蛋白上樣量,組織樣本推薦50~100μg,細(xì)胞樣本推薦20~50μg。
3. Caspase-3 剪切體分子量較少,注意轉(zhuǎn)膜時間不能太久,避免過度轉(zhuǎn)膜,同時膜要使用0.22μm。
我好不容易做出剪切體條帶了，但是趨勢不對，是什么原因呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：做的趨勢不對的時候，也別急著懷疑自己或者懷疑試劑的問題，可以順著現(xiàn)象去探索問題的本質(zhì)，很多出色的研究就是在“違背”我們所認(rèn)為的常理中發(fā)現(xiàn)的。
例如在癌癥治療中，細(xì)胞凋亡是一種公認(rèn)的細(xì)胞死亡機制，細(xì)胞毒性藥物通過它來殺死腫瘤細(xì)胞。但是在這篇研究中《Caspase 3-mediated stimulation of tumor cell repopulation during cancer radiotherapy》，作者發(fā)現(xiàn)快要死亡的腫瘤細(xì)胞利用凋亡過程中產(chǎn)生的強有力的生長刺激信號來重新生長，進(jìn)一步深入發(fā)現(xiàn)Caspase-3作為凋亡的執(zhí)行者，竟然還在生長刺激中起著關(guān)鍵作用。所以說，任何不尋常的可重復(fù)的可靠實驗結(jié)果都值得我們認(rèn)真對待。
怎么樣才能和小優(yōu)細(xì)節(jié)君保持聯(lián)系呢？
小優(yōu)細(xì)節(jié)君：電話：4008-168-068轉(zhuǎn)5，郵箱：techservice@univ-bio.com。
Caspase3相關(guān)產(chǎn)品
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
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Caspase-3 Antibody |
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Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb |
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PARP (46D11) Rabbit mAb |
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Cleaved PARP (Asp214) (D64E10) XP® Rabbit mAb |
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Caspase-9 (C9) Mouse mAb |
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Cleaved Caspase-9 (Asp315) Antibody (Human Specific) |
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Bax (D2E11) Rabbit mAb |
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Bcl-2 (124) Mouse mAb |
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