文章分享：利用合成IL-9受體增強(qiáng)過(guò)繼性細(xì)胞療法及CAR-T療效

本文來(lái)源于微信公眾： 生物研發(fā)筆記 作者：老周

IL-9R CAR-T
不久前，《Immunity》在同一天上線了兩篇有關(guān)IL-9信號(hào)通路增強(qiáng)CAR-T療效的文章，通訊作者分別是CAR-T之父Carl H. June和Anusha Kalbasi。有意思的是，早在2022年，兩人就已經(jīng)合作在《Nature》上發(fā)表了一篇《利用合成IL-9受體增強(qiáng)過(guò)繼性細(xì)胞療法》的文章，今天我們就一起打包學(xué)習(xí)一下吧。

01研究背景與問(wèn)題
過(guò)繼性細(xì)胞療法，如CAR-T、TCR-T，雖然已經(jīng)在血液瘤領(lǐng)域取得了顯著效果，但在治療實(shí)體瘤時(shí)療效有限。主要障礙包括：
（1）免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境（TME）：導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞難以浸潤(rùn)和存活
（2）體內(nèi)擴(kuò)增和持久性差：輸入的T細(xì)胞在體內(nèi)難以有效擴(kuò)增和長(zhǎng)期存活。
（3）T細(xì)胞功能耗竭：即使T細(xì)胞能夠擴(kuò)增，也容易產(chǎn)生終末分化和功能失調(diào)。
（4）對(duì)預(yù)處理化療的依賴：通常需要先進(jìn)行淋巴清除化療（一種有毒性的方案，限制了患者適用性）來(lái)為輸入的T細(xì)胞創(chuàng)造“空間”和細(xì)胞因子環(huán)境。

02正交嵌合IL-9受體 CAR-T
過(guò)繼性T細(xì)胞療法需要“清淋”的一個(gè)主要原因是為輸入的T細(xì)胞創(chuàng)造生長(zhǎng)的空間，避免宿主細(xì)胞過(guò)度消耗IL-2等細(xì)胞因子。如果設(shè)計(jì)一種細(xì)胞因子，能特異性識(shí)別并促進(jìn)過(guò)繼性T細(xì)胞的生長(zhǎng)就能略過(guò)“清淋”這一有害預(yù)處理，這即是正交受體的概念。

設(shè)計(jì)原理：
2022年，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種全新的合成細(xì)胞因子受體系統(tǒng)，即正交合IL-9受體，把正交IL-2受體（o2R）的胞外域（ECD，負(fù)責(zé)與配體結(jié)合）與共同γ鏈細(xì)胞因子受體（如IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-21R）的胞內(nèi)域（ICD，負(fù)責(zé)信號(hào)傳導(dǎo)）進(jìn)行融合。這樣，改造后的T細(xì)胞表達(dá)的嵌合受體只能被相應(yīng)改造的正交IL-2（oIL-2）激活，而不會(huì)被體內(nèi)的天然IL-2激活，實(shí)現(xiàn)了對(duì)輸入T細(xì)胞的“選擇性”調(diào)控。

主要發(fā)現(xiàn)：
該研究發(fā)現(xiàn)，在測(cè)試的多種嵌合受體中， o9R（oIL-2R ECD + IL-9R ICD）T細(xì)胞表現(xiàn)尤為突出。它能夠同時(shí)激活STAT1、STAT3和STAT5信號(hào)通路，這是一種獨(dú)特的信號(hào)組合,使T細(xì)胞表現(xiàn)出更好的抗腫瘤特性：
（1）獲得干細(xì)胞記憶T細(xì)胞（Tscm）表型：o9R信號(hào)誘導(dǎo)T細(xì)胞高表達(dá)CD62L、CD95（Fas）和Sca-1等Tscm細(xì)胞的標(biāo)志，這類(lèi)細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力和持久抗腫瘤活性。
（2）增殖較少但功能更強(qiáng)：o9R T細(xì)胞體外增殖能力弱于o2R T細(xì)胞，但其殺傷活性和干擾素-γ（IFN-γ）的產(chǎn)生能力更強(qiáng)。
（3）獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組特征：o9R信號(hào)賦予了T細(xì)胞一種“混合”表型，同時(shí)激活了與干細(xì)胞特性和效應(yīng)功能/激活相關(guān)的基因，并下調(diào)了與T細(xì)胞功能障礙相關(guān)的基因（如Nr4a1, Tox）。這使其既能保持“年輕”狀態(tài)，又具備強(qiáng)大的即時(shí)殺傷能力。
在胰腺癌模型中，研究采用了瘤內(nèi)注射表達(dá)oIL-2的腺病毒（Ad-oIL-2）的方式，將細(xì)胞因子信號(hào)限制在腫瘤局部。CAR-o9R T細(xì)胞聯(lián)合Ad-oIL-2展現(xiàn)了強(qiáng)大的抗腫瘤活性，即使在無(wú)預(yù)處理化療的小鼠中也能引發(fā)相當(dāng)比例的腫瘤完全消退，效果顯著優(yōu)于CAR-o2R T細(xì)胞。
在人類(lèi)T細(xì)胞中，ho9R信號(hào)同樣能誘導(dǎo)出Tscm表型。在經(jīng)過(guò)多次腫瘤抗原反復(fù)刺激后，ho9R T細(xì)胞比ho2R T細(xì)胞能更好地維持干細(xì)胞特性，并產(chǎn)生更多細(xì)胞因子（如IFN-γ, TNF, IL-2），表現(xiàn)出更強(qiáng)的“多功能性”和持續(xù)殺傷能力。

03天然IL-R受體 CAR-T

理論基礎(chǔ)：
與傳統(tǒng)IL-2R、IL-15R、IL-21R等共同γ鏈細(xì)胞因子受體在體內(nèi)廣泛表達(dá)不同，IL-9R在正常組織（包括T細(xì)胞）中表達(dá)水平極低，這使其成為一個(gè)天然的正交型受體，更安全、更具靶向性

設(shè)計(jì)策略及原理：
以此發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)分別將天然的IL-9R表達(dá)在腫瘤特異性的T細(xì)胞上（CAR-T，TCR-T），構(gòu)造出CAR/TCR-IL9R T細(xì)胞。瘤內(nèi)注射編碼IL-9的腺病毒（Ad-IL-9）在腫瘤局部提供IL-9信號(hào)，或與重組表達(dá)的IL-9聯(lián)合給藥，能選擇性激活并增強(qiáng)CAR-IL9R T細(xì)胞的功能。

Carl H June研究組主要發(fā)現(xiàn)：
● 卓越的抗腫瘤效果
（1）高效低劑量：極低劑量（低至3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞）的CAR-IL9R T細(xì)胞聯(lián)合Ad-IL-9，就能實(shí)現(xiàn)腫瘤的完全消退，其效果遠(yuǎn)優(yōu)于需要百萬(wàn)級(jí)細(xì)胞量的傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞。這大大降低了治療所需的細(xì)胞劑量
（2）長(zhǎng)期持久性與免疫記憶：在腫瘤被清除后，這些小鼠能夠抵抗新一輪的腫瘤攻擊，表明CAR-IL9R T細(xì)胞在體內(nèi)形成了長(zhǎng)期免疫記憶。（3）增強(qiáng)的腫瘤浸潤(rùn)與持久性：CAR-IL9R T細(xì)胞在血液和腫瘤中的擴(kuò)增能力更強(qiáng)，存活時(shí)間更長(zhǎng)（可達(dá)10周）。

● 優(yōu)秀的抗衰竭能力
研究團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）等先進(jìn)技術(shù)解析了IL-9信號(hào)如何重編程CAR-T細(xì)胞：
對(duì)CD8+ T細(xì)胞：IL-9信號(hào)能引導(dǎo)細(xì)胞朝向中央記憶和效應(yīng)狀態(tài)分化，同時(shí)遠(yuǎn)離終末耗竭狀態(tài)。這使得CD8+ CAR-T細(xì)胞既能保持“年輕”、可長(zhǎng)期存活的干細(xì)胞樣特性，又具備強(qiáng)大的即時(shí)殺傷能力。RNA速度分析預(yù)測(cè)，IL-9處理的細(xì)胞會(huì)向功能狀態(tài)演進(jìn)，而對(duì)照組細(xì)胞則走向耗竭。
對(duì)CD4+ T細(xì)胞：IL-9信號(hào)促進(jìn)其向具有增殖能力的效應(yīng)狀態(tài)發(fā)展，并偏向于產(chǎn)生抗腫瘤相關(guān)的Th1和Th9細(xì)胞亞型，這些細(xì)胞能分泌大量IFN-γ和TNF-α等關(guān)鍵抗腫瘤細(xì)胞因子。

● 抗原壓力下維持CAR-T細(xì)胞功能
在體外模擬腫瘤微環(huán)境的持續(xù)抗原刺激實(shí)驗(yàn)中，IL-9信號(hào)幫助CAR-T細(xì)胞：
（1）維持表面CAR的表達(dá)：避免因抗原刺激導(dǎo)致的CAR分子丟失。
（2）保持CD4+和CD8+亞群的平衡。
（3）保留早期記憶表型，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞因子分泌和腫瘤殺傷能力

● STAT4介導(dǎo)的信號(hào)機(jī)制
研究發(fā)現(xiàn)，IL-9信號(hào)不僅能激活經(jīng)典的STAT3和STAT5通路，還意外地、強(qiáng)效地激活了STAT4。STAT4傳統(tǒng)上被認(rèn)為是IL-12信號(hào)的關(guān)鍵介質(zhì)，與Th1細(xì)胞分化和IFN-γ產(chǎn)生密切相關(guān)。通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)敲除STAT4基因證實(shí)，STAT4是IL-9信號(hào)發(fā)揮增強(qiáng)作用（尤其是誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生）的關(guān)鍵分子。這表明IL-9通過(guò)激活STAT4，賦予了CAR-T細(xì)胞更優(yōu)越的功能特性。

Anusha Kalbasi研究團(tuán)隊(duì)主要發(fā)現(xiàn)：
● 與Carl H June研究組的發(fā)現(xiàn)類(lèi)似，Kalbasi團(tuán)隊(duì)也獨(dú)立證明了工程化CAR/TCR-IL9R T細(xì)胞具有高效的抗腫瘤效果，能增強(qiáng)擴(kuò)增與腫瘤浸潤(rùn)，同樣地能誘導(dǎo)干細(xì)胞記憶T細(xì)胞（Tscm）表型--更強(qiáng)的正我更新能力與抗腫瘤活性。

● 機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，IL-9R信號(hào)能激活獨(dú)特的STAT蛋白組合，除了已知的STAT1、STAT3和STAT5，還能強(qiáng)效激活STAT4，這就使IL-9信號(hào)具備了多種細(xì)胞因子的優(yōu)點(diǎn)，即IL-12的效應(yīng)功能（通過(guò)STAT4）、IL-2的增殖能力（通過(guò)STAT5）以及IL-21等的干細(xì)胞特性維持能力（通過(guò)STAT3），這種獨(dú)特的混合信號(hào)優(yōu)勢(shì)是其賦予CAR-T卓越療效的基礎(chǔ)。

● 不同的是，該研究組又進(jìn)一步深入探究了IL-9R信號(hào)強(qiáng)度與抗腫瘤效果之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了“金發(fā)姑娘原則（Goldilocks Principle）”,即IL-9R的信號(hào)強(qiáng)度存在一個(gè)最適窗口，過(guò)弱或過(guò)強(qiáng)的信號(hào)都會(huì)損害療效。

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)指導(dǎo)，對(duì)IL-9或IL-9R進(jìn)行改造，分別削弱（如IL-9Q115T突變）或增強(qiáng)（如IL-9R3x/5x突變）其信號(hào)。結(jié)果表明，無(wú)論是信號(hào)減弱還是過(guò)度增強(qiáng)，都會(huì)削弱T細(xì)胞的抗腫瘤效果。這說(shuō)明天然的IL-9/IL-9R信號(hào)強(qiáng)度本身就處于一個(gè)最優(yōu)區(qū)間。

● 更進(jìn)一步地，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)STAT1作為T(mén)細(xì)胞命運(yùn)的“調(diào)節(jié)器”。通過(guò)精細(xì)設(shè)計(jì)IL-9R胞內(nèi)域的單個(gè)氨基酸突變，研究團(tuán)隊(duì)成功“偏置”了其激活的STAT信號(hào)組合，特別是調(diào)控了STAT1的激活水平，發(fā)現(xiàn)：
（1）高pSTAT1（IL-9RPR突變）：驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞向終末效應(yīng)細(xì)胞分化，增殖能力差，抗腫瘤效果不佳。
（2）低pSTAT1（IL-9RAQ突變）：促使T細(xì)胞維持干細(xì)胞樣和記憶性狀態(tài)，體內(nèi)擴(kuò)增能力極強(qiáng)，但效應(yīng)功能稍弱。
（3）中等pSTAT1（野生型IL-9R）：使T細(xì)胞處于最佳平衡狀態(tài)，同時(shí)具備強(qiáng)大的效應(yīng)功能和持久的記憶潛力，因此抗腫瘤效果最好。

04總結(jié)與意義
兩項(xiàng)研究相互印證又相互補(bǔ)充，系統(tǒng)性地將IL-9/IL-9R從一個(gè)相對(duì)“冷門(mén)”的細(xì)胞因子對(duì)，提升為下一代過(guò)繼性T細(xì)胞療法，特別是實(shí)體瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)極具前景的核心武器，是對(duì)抗實(shí)體瘤的一項(xiàng)突破性進(jìn)展。它們從概念提出、機(jī)制深化到臨床轉(zhuǎn)化前景，構(gòu)成了一個(gè)完整的研究體系，深化了我們對(duì)如何通過(guò)重編程細(xì)胞因子信號(hào)來(lái)優(yōu)化T細(xì)胞命運(yùn)的理解，為未來(lái)開(kāi)發(fā)更智能、更有效的癌癥免疫療法指明了方向。
（1）實(shí)體瘤治療新策略：首次將IL-9/IL-9R作為天然的“正交”系統(tǒng)用于增強(qiáng)工程化T細(xì)胞療法，為克服實(shí)體瘤治療障礙提供了強(qiáng)大、安全的新工具。
（2）闡明新機(jī)制：揭示了IL-9R信號(hào)意外激活STAT4這一全新機(jī)制，并闡明其通過(guò)最優(yōu)的STAT信號(hào)強(qiáng)度和平衡（特別是STAT1的調(diào)節(jié)作用）來(lái)重編程T細(xì)胞命運(yùn)，使其獲得“超級(jí)”抗腫瘤能力。
（3）臨床轉(zhuǎn)化潛力：該策略在多種臨床前模型中均顯示卓越療效，且采用臨床可行的系統(tǒng)給藥方式，為開(kāi)發(fā)下一代針對(duì)實(shí)體瘤的T細(xì)胞療法鋪平了道路。