腫瘤特異性激活的遮蔽型CART細(xì)胞在體內(nèi)的抗腫瘤效果研究

本文來源于微信公眾： Of studies 作者： Of studies

嵌合抗原受體工程化T細(xì)胞（CAR-T）治療是一種強(qiáng)有力的癌癥免疫療法。CAR-T細(xì)胞可被重新定向，特異性識別腫瘤相關(guān)抗原（TAA），并誘導(dǎo)高水平的抗腫瘤活性。然而，由于TAA在健康組織中低水平表達(dá)，它們也可能引發(fā)“靶向腫瘤但脫靶正常組織on target off tumor”的毒性。這些不良反應(yīng)已引起重大安全問題，并限制了這一原本前景廣闊的治療方式的臨床應(yīng)用，遮蔽肽可能是免疫治療的下一個(gè)風(fēng)口。

學(xué)習(xí)一篇很早的2017年發(fā)表在Molecular Therapy的文章，研究者給CART戴上面具，設(shè)計(jì)了一種針對表皮生長因子受體（EGFR）的遮蔽型CAR（masked CAR），其由一段遮蔽肽（可阻斷抗原結(jié)合位點(diǎn)）和一個(gè)蛋白酶敏感連接肽組成。腫瘤微環(huán)境中常見的蛋白酶可切割該連接肽，使遮蔽肽脫落，從而讓CAR-T細(xì)胞僅在腫瘤部位識別靶抗原。體外實(shí)驗(yàn)顯示，在沒有蛋白酶的情況下，masked CAR的抗原結(jié)合能力和抗原特異性激活顯著降低；而在加入特定蛋白酶后，其結(jié)合與活性恢復(fù)至正常水平。遮蔽型CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的抗腫瘤效果與未遮蔽CAR相當(dāng)。

主要結(jié)果
1、EGFR CART的設(shè)計(jì)

編碼masked遮蔽肽序列：QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（源自Cetuximab probody 的抗原結(jié)合位點(diǎn)封閉肽）；
蛋白酶敏感 linker（可切）序列：GSSGGSGGSGGSG-LSGRSDNH-GSSGT；
蛋白酶底物序列LSGRSDNH是uPA/matriptase/legumain（在腫瘤微環(huán)境顯著上調(diào)的蛋白水解酶）的底物核心，兩側(cè)用 GS-rich 柔性鏈隔開。
非切割對照 linker（NSUB）序列：GSSGGSGGSGGSG-GGSGGGSG-GSSGT；
把酶底物序列 -LSGRSDNH- 換成了同長度、不可切的 GS 富集序列（8個(gè)氨基酸）：

2、CAR的表達(dá)和遮蔽情況
從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中分離出的細(xì)胞經(jīng)活化后，用不遮蔽、遮蔽和 NSUB 抗 EGFR 嵌合抗原受體（CAR）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在體外擴(kuò)增10天。PL流式測 CAR 表面表達(dá)，rhEGFR-Fc 流式測結(jié)合能力
三組 CAR 表達(dá)率均 ≈ 30–35 %（無差異）；
結(jié)合率：Unmasked 35 % → Masked 3 % → NSUB 0.4 %；masked把結(jié)合力降到背景，說明遮蔽有效。

（A）用生物素化的蛋白 L 對三組 CAR-T 細(xì)胞進(jìn)行染色，然后用 APC 標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行檢測，以檢測細(xì)胞表面的 CAR 表達(dá)情況。
（B）將 CAR-T 細(xì)胞與重組人 EGFR-Fc 蛋白孵育，然后用 PE 標(biāo)記的山羊抗人 Fc 抗體進(jìn)行染色，以評估 CAR 與其靶抗原人 EGFR 的結(jié)合能力。

3、蛋白酶處理后不同嵌合抗原受體（CAR）與靶抗原 EGFR 的結(jié)合情況
不遮蔽、遮蔽和 NSUB 抗 EGFR CAR-T 細(xì)胞經(jīng)不同濃度（0 nM、100 nM 和 400 nM）尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）處理后，用重組人 EGFR-Fc（rhEGFR-Fc）和山羊抗人 Fc 抗體進(jìn)行染色，以評估蛋白酶處理對 CAR 與抗原結(jié)合的影響。

0 nM 時(shí)結(jié)合 6 %；100 nM 結(jié)合23 %；400 nM 結(jié)合 29 %（接近 Unmasked），結(jié)合恢復(fù)呈uPA劑量依賴， linker 被切。

4、不同靶細(xì)胞刺激下的各種 CAR-T 細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)因子染色
在體外激活和擴(kuò)增 10 天后，未修飾型、修飾型和 NSUB 型 CAR-T 細(xì)胞分別與 K562、K562-EGFR、MDA-MB-231 或 NCI-H292 細(xì)胞共培養(yǎng) 6 小時(shí)。未受刺激的 CAR-T 細(xì)胞用作陰性對照，而受抗 CD3/CD28 抗體刺激的 CAR-T 細(xì)胞用作陽性對照，通過細(xì)胞內(nèi)染色測量干擾素γ（IFN-γ）的產(chǎn)生量。
K562-EGFR穩(wěn)定株高表達(dá)EGFR，但幾乎不分泌 uPA（尿激酶型纖溶酶原激活物-是一種絲氨酸蛋白酶），MDA-MB-231和NCI-H292高分泌uPA。

A圖為一個(gè)donor的代表性流式結(jié)果，B為3個(gè)donor定量數(shù)據(jù)。

Unmasked 對任何 EGFR⁺ 細(xì)胞均 15–20 % IFN-γ⁺；
Masked 對 K562-EGFR （無蛋白酶環(huán)境）僅 0.9 %（關(guān)閉狀態(tài)）；對 MDA231/H292 （分泌蛋白酶環(huán)境）升至 16–17 %（遮蔽型CART的linker裂解，打開EGFR結(jié)合點(diǎn)）；
NSUB 始終 < 7 %；
證明蛋白酶存在才能摘掉面具，“解鎖”T 細(xì)胞激活。

5、不同 CAR-T 細(xì)胞對不同靶細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性作用
CFSE 標(biāo)記靶細(xì)胞 → 與 CAR-T 按 1:1–10:1 共孵 → 7-AAD 流式算存活率

• Unmasked 殺 K562-EGFR、231、H292 均高效；
• Masked 幾乎不殺 K562-EGFR（E:T=10 時(shí)僅 20 % 殺傷），但對 231 和 H292 殺傷可恢復(fù)至 Unmasked 水平；
• NSUB 殺傷始終低下；
  體內(nèi)外功能一致：腫瘤蛋白酶=殺傷開關(guān)。

（A）CAR-T 細(xì)胞以 1:1、3:1 或 10:1 的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例與 K562-EGFR 細(xì)胞共培養(yǎng) 4 小時(shí)，然后測量對 K562-EGFR 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
（B）CAR-T 細(xì)胞以 1：1、3：1 或 10：1 的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例與 NCI-H292 細(xì)胞共培養(yǎng) 18 小時(shí)，并測量細(xì)胞毒性。
（C）CAR-T 細(xì)胞以 1：1、2.5：1、5：1 或 10：1 的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例與 MDA-MB-231 細(xì)胞共培養(yǎng) 18 小時(shí)，并測量細(xì)胞毒性。

6、CAR-T 細(xì)胞在人類肺癌異種移植模型中的抗腫瘤效果
NSG 鼠右脅皮下 NCI-H292 肺癌模型，12 d 后瘤≈120 mm³ → 隨機(jī) 4 組（n=8）,D13、D26 尾靜脈輸注 4×10⁶ CAR-T

Unmasked 與 Masked 均顯著受抑（p<0.05），兩組曲線重疊；NSUB 與對照無差異；Unmasked 中位 50.5 d，Masked 49 d；對照/NSUB 42 d（p<0.01）
遮蔽未削弱體內(nèi)抗腫瘤效果，且安全性提升（無體重下降、皮膚/腸道毒性觀察）。
（A）體內(nèi) CAR-T 治療方案的示意圖。在第 0 天，將 NCI-H292 細(xì)胞注射到 NSG 小鼠的右側(cè)腹側(cè)。將小鼠隨機(jī)分為四組（每組 8 只），分別在第 13 天和第 26 天接受4E6 CAR-T 細(xì)胞的治療；未轉(zhuǎn)導(dǎo)的 T 細(xì)胞作為對照組。每周用卡尺測量腫瘤大小兩次。 （B）各組的腫瘤生長曲線。 （C）使用 Kaplan-Meier 法計(jì)算小鼠生存曲線。

附：
Cetuximab probody 是2013 年AbbVie在Science Translational Medicine報(bào)道的“前體抗體”（pro-antibody）版本 cetuximab，可理解為給原抗體加了一個(gè)可脫卸的“安全帽”，讓它在健康組織保持沉默，到達(dá)腫瘤后才被激活。
結(jié)構(gòu):重鏈 N 端額外融合了一段 12-14 aa 的“遮蔽肽”（masking peptide），遮蔽肽與重鏈之間插入一條腫瘤相關(guān)蛋白酶（uPA、matriptase 等）可切割的 linker。
作用機(jī)制：循環(huán)中：遮蔽肽折疊回來堵住 Fab 的 CDR 區(qū)，EGFR 結(jié)合力降低 50–500 倍，F(xiàn)c 功能也被抑制，幾乎不與正常組織 EGFR 結(jié)合。
腫瘤微環(huán)境：高濃度 uPA/matriptase 把 linker 切斷 → 遮蔽肽脫落 → 抗體“解鎖”，結(jié)合力恢復(fù)至母本 cetuximab （西妥昔單抗靶向EGFR）水平 → 照常阻斷 EGFR 信號并介導(dǎo) ADCC/CDC。

小結(jié)
masked CAR在正常組織靜默，到腫瘤被蛋白酶掀開面具后才完全恢復(fù)結(jié)合-激活-殺傷活性，實(shí)現(xiàn)同等療效同時(shí)把正常組織on-target off-tumor風(fēng)險(xiǎn)壓到最低。這項(xiàng)早期研究證實(shí)了改善傳統(tǒng)CAR安全性的可行性，并可能為今后設(shè)計(jì)靶向廣泛表達(dá)TAA的CAR分子提供新思路。