細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄因子P65磷酸化的誘導(dǎo)刺激方法
小優(yōu)細(xì)節(jié)君在整理過(guò)去一年的咨詢時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)的最多的還是老牌轉(zhuǎn)錄因子P65的磷酸化，其中絕大部分問(wèn)題都是無(wú)條帶。而檢測(cè)P65磷酸化最最關(guān)鍵的就是誘導(dǎo)方式了，于是細(xì)節(jié)君就想知道文獻(xiàn)中都是怎么刺激的。話不多說(shuō)，馬上行動(dòng)，在查閱了一些文獻(xiàn)后（大概300篇，主要關(guān)注細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，因?yàn)閯?dòng)物實(shí)驗(yàn)較難重復(fù)），發(fā)現(xiàn)了以下有趣的數(shù)據(jù)，和各位小伙伴分享一下。
細(xì)胞模型
使用最多的細(xì)胞是RAW264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞），是常用的炎癥細(xì)胞模型之一，而NFκB和炎癥密切相關(guān)，使用RAW細(xì)胞作為模型也理所應(yīng)當(dāng)。其次是BMM/BMDM（骨髓巨噬細(xì)胞），THP-1（人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞），BV2（小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞）等。總體上可以分為三類，一是巨噬細(xì)胞，二是腫瘤細(xì)胞，三是正常細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞是最多的。
刺激物
使用的最多的刺激物為LPS（脂多糖），LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，通過(guò)TLR4來(lái)激活NFκB信號(hào)通路。其次是TNFα，IL-1β這類炎性因子，接下來(lái)是誘導(dǎo)分化的RANKL，PMA，CXCL14，還有一些是雙氧水，高糖等處理。
M1巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)
從上面兩張圖可以看出，巨噬細(xì)胞+LPS/TNFα是最常用的搭配組合，可以聯(lián)想到目前研究很多的M1促炎巨噬細(xì)胞，M1分化意味著NFκB信號(hào)通路的激活和P65的磷酸化。所以當(dāng)我們有時(shí)不確定自己的刺激方式是否合適時(shí)，增加一個(gè)M1陽(yáng)性對(duì)照，就可以排查問(wèn)題了。
LPS刺激條件
有小伙伴要問(wèn)，實(shí)驗(yàn)室有LPS，但是不知道使用濃度和刺激時(shí)間。別急，小優(yōu)細(xì)節(jié)君整理了文獻(xiàn)中LPS的使用濃度和刺激時(shí)間，包含了多種細(xì)胞，可以參考：
在做這張圖之前，小優(yōu)細(xì)節(jié)君認(rèn)為按照常理，刺激濃度越高，刺激時(shí)間會(huì)相應(yīng)短一些。但實(shí)際結(jié)果卻出乎意料，短時(shí)間，低濃度的LPS也足以誘導(dǎo)P65的磷酸化，而高濃度的LPS刺激時(shí)間不減反增。不過(guò)這和研究者的細(xì)胞模型、實(shí)驗(yàn)方案密切有關(guān)，像巨噬細(xì)胞這類，可能低濃度短時(shí)間的刺激就完全足夠了，而正常細(xì)胞可能需要更高濃度和更長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)。
從上圖可以看出，對(duì)于不同的細(xì)胞，LPS刺激的濃度和時(shí)間均有較大的跨度，濃度范圍從10ng/ml-10ug/ml，時(shí)間從10min到48h。從頻率看，最常用的LPS濃度是100ng/ml和1ug/ml，時(shí)間是24h，那么在不確定細(xì)胞類型的情況下，我們就可以把這個(gè)作為摸索最佳刺激條件的起始條件。
腫瘤細(xì)胞
另外，我們還發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞系，本底就有P65磷酸化的表達(dá)。因?yàn)镹FκB可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和抗凋亡基因表達(dá)，并增加血管新生，所以很多研究者把NFκB活化作為癌癥標(biāo)志之一。有一些研究報(bào)道，敲除IKK后可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，所以對(duì)于動(dòng)物腫瘤模型，我們大概率是可以觀察到P65的磷酸化的，不過(guò)對(duì)于所有腫瘤細(xì)胞系，目前還不能一概而論，還需要具體分析。
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)
我們知道如何誘導(dǎo)細(xì)胞了，那就成功一半了，小優(yōu)細(xì)節(jié)君再分享一下其他需要注意的小細(xì)節(jié)：
❖制樣時(shí)裂解液務(wù)必添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，增加超聲處理，充分裂解樣本。
❖磷酸化容易降解，盡量使用新鮮樣本，全程低溫操作。
❖封閉液可以使用5%脫脂奶粉，一抗稀釋液建議使用5%BSA。
❖磷酸化的P65既存在于胞漿，也可能會(huì)進(jìn)入核內(nèi)，如果需要分開(kāi)分析，需要制備胞漿胞核裂解液。
參考文獻(xiàn)太多，具體請(qǐng)見(jiàn)小優(yōu)細(xì)節(jié)君嘔心瀝血整理的表格，下圖僅展示一部分。有需要的小伙伴可以收藏，轉(zhuǎn)發(fā)，找我們的工作人員索要。
推薦產(chǎn)品助力您的實(shí)驗(yàn)：
細(xì)胞模型
使用最多的細(xì)胞是RAW264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞），是常用的炎癥細(xì)胞模型之一，而NFκB和炎癥密切相關(guān)，使用RAW細(xì)胞作為模型也理所應(yīng)當(dāng)。其次是BMM/BMDM（骨髓巨噬細(xì)胞），THP-1（人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞），BV2（小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞）等。總體上可以分為三類，一是巨噬細(xì)胞，二是腫瘤細(xì)胞，三是正常細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞是最多的。
圖1 檢測(cè)p-p65使用的細(xì)胞模型比例
刺激物
使用的最多的刺激物為LPS（脂多糖），LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，通過(guò)TLR4來(lái)激活NFκB信號(hào)通路。其次是TNFα，IL-1β這類炎性因子，接下來(lái)是誘導(dǎo)分化的RANKL，PMA，CXCL14，還有一些是雙氧水，高糖等處理。
圖2 檢測(cè)p-p65使用的刺激物比例
M1巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)
從上面兩張圖可以看出，巨噬細(xì)胞+LPS/TNFα是最常用的搭配組合，可以聯(lián)想到目前研究很多的M1促炎巨噬細(xì)胞，M1分化意味著NFκB信號(hào)通路的激活和P65的磷酸化。所以當(dāng)我們有時(shí)不確定自己的刺激方式是否合適時(shí)，增加一個(gè)M1陽(yáng)性對(duì)照，就可以排查問(wèn)題了。
圖3 巨噬細(xì)胞分型及對(duì)應(yīng)刺激和marker
LPS刺激條件
有小伙伴要問(wèn)，實(shí)驗(yàn)室有LPS，但是不知道使用濃度和刺激時(shí)間。別急，小優(yōu)細(xì)節(jié)君整理了文獻(xiàn)中LPS的使用濃度和刺激時(shí)間，包含了多種細(xì)胞，可以參考：
圖4 LPS的刺激濃度和時(shí)間分布圖
在做這張圖之前，小優(yōu)細(xì)節(jié)君認(rèn)為按照常理，刺激濃度越高，刺激時(shí)間會(huì)相應(yīng)短一些。但實(shí)際結(jié)果卻出乎意料，短時(shí)間，低濃度的LPS也足以誘導(dǎo)P65的磷酸化，而高濃度的LPS刺激時(shí)間不減反增。不過(guò)這和研究者的細(xì)胞模型、實(shí)驗(yàn)方案密切有關(guān)，像巨噬細(xì)胞這類，可能低濃度短時(shí)間的刺激就完全足夠了，而正常細(xì)胞可能需要更高濃度和更長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)。
從上圖可以看出，對(duì)于不同的細(xì)胞，LPS刺激的濃度和時(shí)間均有較大的跨度，濃度范圍從10ng/ml-10ug/ml，時(shí)間從10min到48h。從頻率看，最常用的LPS濃度是100ng/ml和1ug/ml，時(shí)間是24h，那么在不確定細(xì)胞類型的情況下，我們就可以把這個(gè)作為摸索最佳刺激條件的起始條件。
腫瘤細(xì)胞
另外，我們還發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞系，本底就有P65磷酸化的表達(dá)。因?yàn)镹FκB可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和抗凋亡基因表達(dá)，并增加血管新生，所以很多研究者把NFκB活化作為癌癥標(biāo)志之一。有一些研究報(bào)道，敲除IKK后可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，所以對(duì)于動(dòng)物腫瘤模型，我們大概率是可以觀察到P65的磷酸化的，不過(guò)對(duì)于所有腫瘤細(xì)胞系，目前還不能一概而論，還需要具體分析。
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)
我們知道如何誘導(dǎo)細(xì)胞了，那就成功一半了，小優(yōu)細(xì)節(jié)君再分享一下其他需要注意的小細(xì)節(jié)：
❖制樣時(shí)裂解液務(wù)必添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，增加超聲處理，充分裂解樣本。
❖磷酸化容易降解，盡量使用新鮮樣本，全程低溫操作。
❖封閉液可以使用5%脫脂奶粉，一抗稀釋液建議使用5%BSA。
❖磷酸化的P65既存在于胞漿，也可能會(huì)進(jìn)入核內(nèi)，如果需要分開(kāi)分析，需要制備胞漿胞核裂解液。
參考文獻(xiàn)太多，具體請(qǐng)見(jiàn)小優(yōu)細(xì)節(jié)君嘔心瀝血整理的表格，下圖僅展示一部分。有需要的小伙伴可以收藏，轉(zhuǎn)發(fā)，找我們的工作人員索要。
推薦產(chǎn)品助力您的實(shí)驗(yàn)：
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產(chǎn)品貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
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Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb |
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NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb |
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Phospho-NF-κB p65 (Ser468) Antibody |
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脂多糖（O55:B5） |
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脂多糖（O111:B4） |
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Recombinant Human TNF-α Protein |
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Recombinant Mouse TNF-α,80-235a.a. |
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Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF |
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Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein |
- A-769662作為AMPK激活劑在炎癥、動(dòng)物肥胖和腫瘤模型中的研究應(yīng)用
- SBI-0206965作為ULK1/2與AMPK雙重抑制劑在腫瘤研究中的應(yīng)用
- Everolimus (RAD001)作為mTOR抑制劑在炎癥、免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用
- 核受體共激活因子RAP250作為BAT代謝負(fù)調(diào)控因子的作用機(jī)制研究
- AZD8055作為mTOR抑制劑的機(jī)制及在腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的研究應(yīng)用
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