小分子蛋白WB檢測技巧及獲得理想條帶的辦法
凝膠體系
有研究者提出可以減少電泳中SDS的用量，但效果并不佳。Schagger[1]等提出可以在高離子強度下電泳來實現更好的分離效果，他們用三羥甲基氨基甘氨酸（Tricine）代替甘氨酸（Gly），形成了一種新的Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳體系。與Gly（pK 9.6）相比，Tricine（pK 8.15）在pH為6.8~8.8時，更多以陰離子形式存在，在膠中的遷移速度更快，能夠顯著提高對小分子蛋白的分離效果。用兩種體系對相同樣本進行檢測，Tricine-SDS-PAGE能夠有效分離17.2-2.5kDa的蛋白（Fig.1a），而相同實驗步驟下，Glycine-SDS-PAGE體系分離效果較差，條帶并未被分離（Fig.1 b）。
與常規(guī)的體系相比，Tricine-SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)一般需要使用2種不同的緩沖液：陽極緩沖液和陰極緩沖液，陰極緩沖液中用Tricine代替Glycine。電泳時在電泳槽底部加入陽極緩沖液，兩塊膠的中間槽加入陰極緩沖液，實現對小分子蛋白更有效的分離。
凝膠濃度
凝膠濃度決定孔徑，孔徑是影響蛋白在電場中遷移速度的重要影響因素。凝膠的孔徑越小，小分子蛋白在其中遷移的速度越慢，分辨效果也越好。
分離膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的比例會影響凝膠的孔徑大小。在Tricine-SDS-PAGE體系中，通過對比凝膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的不同比例和交聯度，發(fā)現經過改進的比例較原先的分離效果更好，可以更精細地分辨1-100kDa之間的蛋白[2]。如Fig.2a、b、c，改變凝膠中兩種單體的百分比和交聯度對于同一樣品的分離效率不同。
在分離膠中添加尿素也可以提高膠的分離效果。尿素可以改變凝膠的結構，降低凝膠孔徑的大小。在分離膠中添加一定比例的尿素，可以增強對小分子蛋白的分離效果[3，4]（Fig.2d）。另有一些研究發(fā)現在分離膠中添加甘油也可以起到與尿素一樣的效果[5]。
電泳條件
在電泳時控制跑膠時間，保證小分子蛋白與內參分開，盡量不要跑太久，前沿接近膠底部即可。嘗試用恒流進行電泳，濃縮膠推薦30mA，分離膠推薦45mA。
電泳過程中注意降溫，溫度升高會加快小蛋白分子的運動，增加彌散速度。
轉膜條件
可以適當減少轉膜時間，降低轉膜的電壓電流，防止過轉。同時在轉膜后可以用麗春紅染色確保轉膜成功。建議使用0.22μm孔徑的膜，且可以將膜在甲醇中激活的時間延長至2~3min，增加膜與蛋白的結合率。
其他小細節(jié)
（1）確定樣本中靶標蛋白的表達量，可以通過The Human Protein Atlas、GeneCards、BioGPS等數據庫查詢。很多小分子蛋白需要適當刺激才能誘導表達，所以實驗前要做好充分的文獻調研。
（2）在樣本制備過程中添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解；在制樣過程中增加超聲處理，盡可能的充分裂解樣品，暴露抗原表位。盡量使用新鮮樣本進行實驗。
（3）小分子蛋白由于彌散拖尾現象較多，最好是保留3個以上marker，或者做全膜，避免蛋白被裁去。
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產品貨號 |
產品名稱 |
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Color-coded Prestained Protein Marker, Low Range (1.7-42 kDa) |
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藍色預染蛋白 Marker (3.3-31kDa) |
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預制膠（15%，10wells） |
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預制膠（15%，15wells） |
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預制膠（8-20%，10wells） |
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3-5kDa小分子量預制膠（16.5%，15wells） |
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3-5kDa小分子量預制膠（16.5%，10wells） |
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3-5kDa小分子量預制膠試劑盒（16.5%，10wells） |
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3-5kDa小分子量預制膠試劑盒（16.5%，15wells） |
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Tris-Tricine陽極緩沖液（5×） |
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Tris-Tricine陰極緩沖液（5×） |
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小分子蛋白上樣緩沖液（2×） |
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PVDF膜（0.22μm） |
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麗春紅S染色液 |
參考文獻：
[1] Schägger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 1987 Nov 1;166(2):368-79. doi: 10.1016/0003-2697(87)90587-2. PMID: 2449095
[2] 曹佐武.有效分離1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法[J]. 中國生物工程雜志, 2004(01): 74-76. DOI:10.13523/j.cb.20040118.
[3] Schägger H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 2006;1(1): 16-22.doi: 10.1038/nprot.2006.4. PMID: 17406207
[4] 詹玉春,劉文斌.用SDS-PAGE電泳測定豆粕酶解物中的低分子多肽分子量[J].畜牧與獸醫(yī), 2004(11): 4-6.
[5] 江龍法,錢志剛,楊海麟等.用于分離小分子肽的凝膠電泳的改進研究[J].化學世界, 2007(04): 200-202. DOI: 10.19500/j.cnki.0367-6358.2007.04.003.
