膠原酶的類型、使用技巧及在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

在生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，研究人員常常面臨一個(gè)挑戰(zhàn)：如何有效分離完整細(xì)胞并保持其活性？傳統(tǒng)方法往往會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，而膠原酶的出現(xiàn)徹底改變了這一局面。

這種酶能夠特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不會(huì)損傷其他蛋白質(zhì)和組織。

01 什么是膠原酶？
膠原酶，其化學(xué)名為膠原蛋白水解酶（Collagenase），是一種能在生理PH和溫度條件下特異性水解天然膠原蛋白三維螺旋結(jié)構(gòu)的酶。

它的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此對(duì)溫度、PH和導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的各種因素均非常敏感。

膠原酶按照存在方式可分為兩大類：人體內(nèi)源性膠原酶和藥用膠原酶。

• 內(nèi)源性膠原酶是人體內(nèi)部本身具有的，存在于牙齦、觸膜等上皮組織和關(guān)節(jié)滑膜、椎間盤內(nèi)。
• 而藥用膠原酶則是利用生物制藥手段從溶組織梭狀芽孢桿菌的發(fā)酵液中提取、純化并精制而成的白色或類白色無(wú)菌凍干粉針生物制劑。

02 膠原酶的不同類型
膠原酶不是一個(gè)單一的實(shí)體，而是一個(gè)包含多種類型的酶家族，每種類型都有其特定的應(yīng)用場(chǎng)景。
根據(jù)搜索結(jié)果，主要可分為以下幾種類型：

• Ⅰ型膠原酶：主要用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離。它適用于消化組織中連接部分使其成為單個(gè)細(xì)胞，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分離。
• Ⅱ型膠原酶：適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。
• Ⅳ型膠原酶：包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。
• Ⅴ型膠原酶：同樣包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用于胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單個(gè)細(xì)胞。

此外，還有肝細(xì)胞專用膠原酶滿足特定細(xì)胞類型的分離需求。

03 膠原酶的多樣化應(yīng)用
細(xì)胞分離與組織消化
膠原酶在細(xì)胞分離和組織消化方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)需要消化的組織較硬，內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時(shí)，胰蛋白酶解離細(xì)胞的效果往往不佳，而膠原酶則能有效解決這一問(wèn)題。

膠原酶僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大，因此特別適用于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，能使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。

常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%。

疾病模型建立
在科學(xué)研究中，膠原酶被廣泛用于建立各種疾病模型。例如，研究人員可以通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射膠原酶的方法誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病動(dòng)物模型。

復(fù)制方法通常是用體重為15-20kg的無(wú)角騸努比羊，在動(dòng)物麻醉后，在一側(cè)關(guān)節(jié)上腔按478U/kg體重的劑量注射0.5%-1%膠原酶。

這種模型動(dòng)物均于注藥1個(gè)月后出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)病病理?yè)p傷，并隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。

臨床治療應(yīng)用
膠原酶在臨床治療中也展現(xiàn)出巨大潛力。在脊椎介入治療中，膠原酶是用于治療椎間盤源性疼痛的關(guān)鍵藥物。

在影像設(shè)備引導(dǎo)下，膠原酶可被準(zhǔn)確注射到椎間盤組織突出物周圍并使其溶解，從而有效解除其對(duì)脊神經(jīng)的壓迫，達(dá)到解除或緩解疼痛的目的。

研究還探索了膠原酶對(duì)減少假體包膜形成及攣縮的作用。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心進(jìn)行的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，膠原酶能有效降解包膜組織的膠原纖維，減少包膜的形成，對(duì)包膜攣縮有一定的防治意義。

04 膠原酶的使用技巧
配置方法
膠原酶的配置需要注意，因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比較大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。

值得注意的是，鈣、鎂離子和血清成分不會(huì)影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養(yǎng)液配制。

消化過(guò)程
將漂洗、修剪干凈的組織剪成1-2mm³左右的小塊。將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30-50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。

將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內(nèi)，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恒溫震蕩水浴箱中則更好。

消化時(shí)間與組織的類別很有關(guān)系，對(duì)于某些腫瘤組織或其他較致密結(jié)締組織，消化時(shí)間可能需要4-48h，對(duì)于容易消化的組織可以采用37℃震蕩消化15-45分鐘。

消化終點(diǎn)的判斷與細(xì)胞收集
當(dāng)組織塊已分散而失去塊的形狀，一經(jīng)搖動(dòng)即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，可以認(rèn)為已消化充分。

上皮組織經(jīng)膠原酶消化后，由于上皮細(xì)胞對(duì)此酶有耐受性，可能仍有一些細(xì)胞團(tuán)未完全分散，但成團(tuán)的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)。

收集消化液（有時(shí)含個(gè)別組織塊及沒(méi)有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無(wú)血清培養(yǎng)液離心漂洗1-2次，去除上清，加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)瓶。

05 膠原酶在實(shí)驗(yàn)研究中的典型應(yīng)用
椎間盤研究
天津醫(yī)科大學(xué)2005年的一項(xiàng)研究探討了不同濃度膠原酶對(duì)人工培養(yǎng)的椎間盤組織和細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響。

研究將人變性間盤組織或家兔正常間盤組織在無(wú)菌狀態(tài)下剪切，置于含DMEM高糖培養(yǎng)基、20%胎牛血清及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

研究人員分別加入200U/ml及400U/ml膠原酶200μl，觀察各組24小時(shí)、48小時(shí)、1周時(shí)的形態(tài)學(xué)變化，通過(guò)濕重稱量和活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)探討膠原酶對(duì)椎間盤組織的溶解作用。

角膜病變治療
國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)醫(yī)院2019年進(jìn)行的一項(xiàng)研究探索了膠原酶A在治療角膜病變中的應(yīng)用。

研究人員通過(guò)用膠原酶A替換分散酶II/胰蛋白酶-EDTA，修改了分離角膜緣干細(xì)胞的過(guò)程，從而無(wú)需使用飼養(yǎng)細(xì)胞。

這種方法被稱為膠原酶A輔助培養(yǎng)的口腔粘膜上皮移植（CA-COMET），為治療雙側(cè)全角膜緣細(xì)胞缺損提供了一種新方法。

癌癥研究
膠原酶也在癌癥研究中發(fā)揮作用。一項(xiàng)關(guān)于Ⅳ型膠原酶在肝癌小鼠移植瘤中表達(dá)的研究，通過(guò)肝被膜下注射和皮下注射癌細(xì)胞懸液的方法分別建立了原位移植和異位移植的肝癌小鼠模型。

通過(guò)酶譜法分析不同模型中Ⅳ型膠原酶比活性，研究者初步探討了原位移植模型導(dǎo)致高轉(zhuǎn)移的原因。

膠原酶在科學(xué)研究和臨床治療中展現(xiàn)出廣闊前景。隨著生物技術(shù)不斷發(fā)展，我們對(duì)膠原酶的理解也將日益深入。

未來(lái)，這種高效的生物工具或許能在組織工程、再生醫(yī)學(xué)及疾病治療等領(lǐng)域帶來(lái)更多突破性進(jìn)展�？此莆⑿�，卻正在推動(dòng)醫(yī)學(xué)研究不斷向前。

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