2026《歐洲藥典》更新支原體檢測章節(jié)中“上清+細胞”的取樣要求介紹

• 核心變化：從“固定程序”轉(zhuǎn)向基于風險評估（Risk Assessment）的方法選擇，強調(diào)科學決策。
• 技術(shù)升級： 核酸擴增技術(shù)（NAT）地位提升，成為與培養(yǎng)法并列的核心方法，并建立了詳細的驗證標準。
• 操作規(guī)范： 明確了“上清+細胞”的聯(lián)合取樣要求，以確保檢測的全面性。
• 質(zhì)量控制： 新增了針對NAT和指示細胞法的抑制物測試要求，強化了檢測結(jié)果的有效性。

• 支原體屬（Mycoplasma）
• 支原體形屬（Mycoplasmoides）
• 中支原體屬（Mesomycoplasma）
• 后支原體屬（Metamycoplasma）
• 支原體蟲屬（Mycoplasmosis）
• 脲原體屬（Ureaplasma）
• 無膽甾原體屬（Acholeplasma）
• 螺原體屬（Spiroplasma）

而舊版僅籠統(tǒng)稱為“mycoplasmas”。

（2）引入風險評估原則
新版重點強調(diào)方法選擇應基于風險評估（risk assessment），需考慮培養(yǎng)基、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品類型、潛在污染物種類等因素。這是一個根本性的理念轉(zhuǎn)變，從固定的程序轉(zhuǎn)向基于科學的風險管理。

（3）明確取樣要求
新版新增并強調(diào)：由于支原體可能附著或存在于細胞內(nèi)，檢測時應同時取樣細胞和上清液（whenever possible）。

（4）增加抑制物測試
除了在培養(yǎng)法延續(xù)保留抑制物測試，在指示細胞法和核酸法都新增了抑制物測試，并提出了具體方案和測試內(nèi)容。

02 關(guān)于核酸擴增技術(shù)（NAT）
（1）地位明確
在新版開篇即介紹了“本章描述了三種支原體檢測方法：培養(yǎng)法、指示細胞培養(yǎng)法和核酸擴增技術(shù)（NAT）”，再次明確了“在經(jīng)過適當驗證后，NAT可作為上述一種或兩種方法的替代方法。”

（2）分類細化
新版將NAT細分為三種應用模式：

• 直接NAT（Direct NAT）
• 基于細胞的富集后NAT（Cell-based enrichment followed by NAT）
• 基于培養(yǎng)基的富集后NAT（Media-based enrichment followed by NAT）

（3）驗證要求具體化
新版為NAT提供了極其詳細的驗證指南，包括：

• 明確的可比性標準：作為培養(yǎng)法替代方法需達到≤10 CFU/mL的靈敏度；作為指示細胞法替代方法需達到≤100 CFU/mL的靈敏度。
• 參考標準品：引入了WHO支原體DNA國際標準品（WHO IS for mycoplasma DNA）作為校準工具。
• 菌株表征：對用于驗證用的菌株制備和表征提出了明確要求。其中，對活菌參考品同時進行CFU（菌落形成單位）和GC（基因組拷貝數(shù)）的測定，并定義了GC/CFU比率（應<10）的接受標準，使NAT結(jié)果更具可比性和可靠性。
• 檢測限：應使用一組已表征和校準的菌株進行一系列的稀釋。如果僅使用DNA標準品應加以論證。
• 抑制性物質(zhì)測試：為NAT專門提出了抑制性物質(zhì)測試要求，并在驗證指南中示例了測試方案。

03 培養(yǎng)法與指示細胞法的優(yōu)化
（1）明確培養(yǎng)條件適用性
培養(yǎng)法與指示細胞培養(yǎng)法僅適用于最適生長溫度35–38℃的菌種；未提及的產(chǎn)品相關(guān)菌種或檢測昆蟲、魚類、植物細胞系等其他細胞生產(chǎn)系統(tǒng)可能需另設(shè)條件。

（2）抑制性物質(zhì)測試
新版培養(yǎng)法里繼續(xù)沿用舊版的抑制性物質(zhì)測試內(nèi)容，在指示細胞法新增抑制性物質(zhì)測試，強調(diào)了抑制性物質(zhì)測試是針對特定產(chǎn)品的，且在工藝變更后需重新進行。新版EP2.6.7培養(yǎng)法和指示細胞法在遇到抑制性物質(zhì)時的處理策略有不同側(cè)重點：

i. 培養(yǎng)法中的抑制性物質(zhì)處理方式
主要策略：稀釋 (Dilution)

• 原理：通過降低待檢產(chǎn)品在培養(yǎng)基中的最終濃度，來減弱或消除其抑制效應。
• 驗證：必須通過重復抑制性物質(zhì)測試來證明所采用的稀釋方案能有效中和抑制作用。

• 同樣適用！新版EP明確指出：“若進行樣品稀釋，可使用更大體積的培養(yǎng)基或?qū)⒔臃N物體積分配到多個細胞培養(yǎng)容器中。”
• 這與培養(yǎng)法的思路一致，通過降低產(chǎn)品濃度來減輕對細胞的毒性或?qū)χг�體附著的干擾。

• 特指針對病毒產(chǎn)品的場景。
• 原理：如果待檢產(chǎn)品是具有細胞病變效應（CPE）的病毒懸液，病毒本身會殺死指示細胞，導致無法觀察。此時，可以使用對該病毒有特異性、但對支原體無抑制作用的抗血清來中和病毒的感染性，從而保護指示細胞。
• 關(guān)鍵點：“中和”在這里是一個非常具體的操作，專指用抗血清對抗病毒，而不是泛指所有抑制性物質(zhì)的處理。

• 新版EP提到，在某些復雜情況下，可以采用“檢測對照細胞”等替代方法，但這些方法必須經(jīng)過充分論證并獲得監(jiān)管機構(gòu)批準。

04 理念與措辭的與時俱進
（1）聯(lián)合使用原則的靈活性
舊版規(guī)定“必須”（are used）聯(lián)合使用兩種方法。新版改為“應聯(lián)合使用（should be used conjointly）”，但增加了重要的例外條款：“除非各論另有規(guī)定，或經(jīng)風險評估證明并獲得主管當局授權(quán)”，確保“可培養(yǎng)”和“不可培養(yǎng)”支原體的檢出。這體現(xiàn)了監(jiān)管的靈活性和基于科學決策的原則。

（2）強調(diào)“有效性”（validity）
新版在結(jié)果解釋部分更清晰地定義了試驗無效的各種情況，強化了質(zhì)量控制的概念。

新版EP 2.6.7相較于舊版，其核心變化在于：

1. 從固定程序到基于風險：引入風險評估作為方法選擇的基礎(chǔ)。
2. 全面擁抱NAT技術(shù)：將NAT的地位提升至核心方法，并為其建立了全面、嚴謹、可量化的驗證和應用框架。
3. 內(nèi)容更全面、精確：更精確地明確了支原體檢測范圍（如螺原體），細化了操作要求、明確了取樣策略。
4. 語言和結(jié)構(gòu)更現(xiàn)代化：文本結(jié)構(gòu)清晰，邏輯嚴謹，術(shù)語準確，更符合當前GMP和監(jiān)管科學的要求。

這些修改反映了近幾年生物制藥行業(yè)，特別是在細胞庫、病毒載體和先進治療產(chǎn)品（ATMPs）等領(lǐng)域的發(fā)展，以及對快速、靈敏、可靠的支原體檢測方法的迫切需求。

相比于其他國家藥典，EP 2.6.7較早收錄了NAT方法。到目前為止，我國藥典還沒有支原體NAT法章節(jié)。在實際檢測實踐中，我們常參照EP 2.6.7。新版EP 2.6.7的修改對我們實際的支原體檢測實踐具有重要的參考和指導意義。

湖州申科開發(fā)了系列支原體DNA提取、檢測試劑盒及驗證菌株，符合新版《歐洲藥典》支原體檢測要求，助力產(chǎn)品合規(guī)放行。