流式細(xì)胞技術(shù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及流程詳解

Section.01
流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞技術(shù)是一種對(duì)懸浮在流體中的單個(gè)細(xì)胞或其他生物顆粒進(jìn)行快速、多參數(shù)、定量分析和分選的技術(shù)。

『原理』：經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞在鞘液包裹下形成單細(xì)胞流，依次通過(guò)激光檢測(cè)區(qū)。激光照射細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生兩種關(guān)鍵信號(hào)：散射光 (反映細(xì)胞大小和內(nèi)部復(fù)雜度) 和熒光 (揭示特定分子標(biāo)記)。這些光信號(hào)被精密的光學(xué)系統(tǒng)接收并轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理形成直觀圖譜。——從而對(duì)異質(zhì)性細(xì)胞群體進(jìn)行細(xì)分與定量統(tǒng)計(jì)。
 
圖 1.流式細(xì)胞術(shù)原理圖^[1]。

此外，具備分選功能的儀器還能通過(guò)使液滴帶電的方式，將特定目標(biāo)細(xì)胞精準(zhǔn)分離出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)高速、高純度的細(xì)胞分選，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域。

Section.02
對(duì)照組設(shè)計(jì)

對(duì)照組的設(shè)置是實(shí)驗(yàn)的基石，其根本目的是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性、準(zhǔn)確性和可解釋性。

陰性對(duì)照

• Blank Control：空白對(duì)照/未染色對(duì)照，不加任何抗體的細(xì)胞。用來(lái)確定陰性細(xì)胞群的物理特性 (大小、顆粒度)，作為調(diào)節(jié)電壓的初始參考，并觀察細(xì)胞的自發(fā)熒光背景。
• ​Isotype Control：同型對(duì)照，使用與一抗同種屬、同亞型、同標(biāo)記的非特異性抗體，用于排除抗體的非特異性結(jié)合。

​生物學(xué)對(duì)照

• Positive/Negative Control：陽(yáng)性/陰性生物學(xué)對(duì)照，已知表達(dá)/不表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞樣本。

​多色實(shí)驗(yàn)對(duì)照

• FMO Control：Fluorescence-Minus-One Control, 熒光減一對(duì)照。在一個(gè)多色染色 Panel 中，去掉其中一種抗體，其余抗體照常加入。在扣除一個(gè)顏色后，我們可以直觀看到其他熒光基團(tuán)在扣除顏色的通道上的溢漏，從而能更準(zhǔn)確地設(shè)置圈門位置。
• ​Single-Stained Control：單陽(yáng)管/單染對(duì)照，每管只加一種熒光標(biāo)記的抗體。這是進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)的關(guān)鍵！另外也可以協(xié)同調(diào)電壓，防止陽(yáng)性信號(hào)超出接收范圍。

 

 
第一步：樣本制備

『全血/PMBC』

1. 紅細(xì)胞裂解：使用紅細(xì)胞裂解液，在染色后或染色前裂解紅細(xì)胞。注意裂解后需用 PBS 充分洗滌。
2. 密度梯度離心 (如 Ficoll)：用于分離 PBMC，可獲得高純度的淋巴細(xì)胞。

『細(xì)胞系』

1. 貼壁細(xì)胞系：用胰酶 (含 EDTA) 消化細(xì)胞。在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙變大時(shí)，加入含血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其脫離培養(yǎng)皿表面，形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，300-500g 離心 5 min，棄上清，PBS 重懸洗滌。
2. 懸浮細(xì)胞系：直接收集細(xì)胞培養(yǎng)液，300-500g 離心 5 min，棄上清，PBS 重懸洗滌。

『組織樣本』

1. 機(jī)械分離：在含血清的培養(yǎng)基或 PBS 中，用注射器活塞、研磨棒或 70μm 細(xì)胞篩網(wǎng)研磨。
2. 酶學(xué)消化：對(duì)于致密組織 (如實(shí)體瘤)，使用膠原酶、DNA 酶等混合酶液在 37°C 下消化 15-45 min，以解離細(xì)胞。注意處理后必須過(guò) 70μm 濾網(wǎng)，以去除細(xì)胞團(tuán)塊和碎片。

第二步：細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測(cè)

『細(xì)胞計(jì)數(shù)』

使用血球計(jì)數(shù)板或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1. 取少量細(xì)胞懸液，與臺(tái)盼藍(lán)或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀專用染料混合。
2. 進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞濃度和活力�；盍�應(yīng)高于 90%。

『活力檢測(cè)』

『原理』：死細(xì)胞容易與抗體非特異性結(jié)合，使用活性染料可以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，并在數(shù)據(jù)采集和分析過(guò)程中排除死細(xì)胞。

死活染料分為“可固定”與“不可固定”。核心在于染料分子是否能穿透完整的細(xì)胞膜，以及其與核酸結(jié)合的方式是否耐受固定劑 (如多聚甲醛)的破壞。

 
第三步：固定和透化

『原理』：固定步驟是為了保留細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 通透步驟會(huì)破壞細(xì)胞膜，使抗體進(jìn)入細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)進(jìn)行染色。對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)進(jìn)行染色時(shí)，須進(jìn)行額外的固定和通透步驟。 

圖 2. 固定和透化模式圖。

『固定』

『操作』：

1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛冰上固定細(xì)胞 15 ~ 20 min；
2. 洗滌：減速離心細(xì)胞 (200 x g, 5 min, 4°C) 得到沉淀，棄去上清液，并在洗滌緩沖液中重懸沉淀。清洗 3 次，以去除殘留的固定液。

『注意』：

① 針對(duì)不同的抗原，需要優(yōu)化固定步驟。
② 有些表位對(duì)甲醇非常敏感，因此如果檢測(cè)出現(xiàn)任何問(wèn)題，可以嘗試使用丙酮。
③ 洗滌次數(shù)、離心時(shí)間和速度可能需要優(yōu)化。

表1. 常用固定試劑

 
『透化』

『操作』：

1. 一邊溫和渦旋細(xì)胞，一邊向細(xì)胞中緩慢添加預(yù)冷的甲醇，使細(xì)胞透化。
2. 在冰上透化 10-20  min。

『注意』：

① 如果已使用有機(jī)溶劑 (甲醇、丙酮) 作固定劑，則不需要該步驟，因?yàn)楸�酮也可以通透�?xì)胞。
② 最佳洗滌劑取決于蛋白及其定位。Triton 或 NP-40 等強(qiáng)效洗滌劑還會(huì)溶解部分核膜，因此適用于核抗原染色。而吐溫 20 或皂素等溫和洗滌劑，能夠在不溶解質(zhì)膜的同時(shí)使抗體穿過(guò)孔，因此適合細(xì)胞質(zhì)中的抗原，或質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)面和可溶性核抗原。

表2. 常用透化試劑

 
第四步：封閉

該步驟用于減少非特異性結(jié)合，從而降低背景信號(hào)，提高信噪比和數(shù)據(jù)質(zhì)量。可分為 Fc 受體封閉劑和非特異性蛋白封閉劑兩類。
 

 
『操作』：

1. 減速離心細(xì)胞 (200 x g，5 min，4°C) 得到沉淀，棄去上清液。
2. 加入封閉緩沖液，輕輕吹打混勻重懸沉淀。4'℃ 避光孵育細(xì)胞 30-60 min。

第五步：抗體孵育

該步驟用使抗體充分與目的蛋白抗原結(jié)合，決定了熒光信號(hào)的位置和特異性，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

該步驟可選擇 (i)直接檢測(cè)：一抗直接與熒光基團(tuán)偶聯(lián)。(ii) 間接檢測(cè)：使用合適的熒光標(biāo)記二抗檢測(cè)一抗。這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。
 
圖 4. 直接法和間接法示意圖。

『操作』：(以直接檢測(cè)為例)

1. 孵育：冰上或 4°C 避光孵育 20-30 min。
2. 洗滌：加入過(guò)量洗滌緩沖液，離心 (300-400g, 5 min)，棄上清。重復(fù) 1-2 次以去除未結(jié)合的抗體。

第六步：上機(jī)檢測(cè)

抗體孵育后，將細(xì)胞充分重懸于適量 PBS 或鞘液中進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

 

產(chǎn)品推薦

Cytokeratin 15 Antibody (YA1493) HY-P81748，Cytokeratin 15 Antibody (YA1493) 是一個(gè)兔來(lái)源、無(wú)偶聯(lián)標(biāo)記、抗 Cytokeratin 15 的 IgG 單克隆抗體。

CD45 Antibody (YA533) HY-P80063，CD45 Antibody (YA533) 是一個(gè)兔來(lái)源、無(wú)偶聯(lián)標(biāo)記、抗 CD45 的 IgG 單克隆抗體。

Rat Anti-Mouse CD86 Antibody (FITC) (YA3447) HY-P83710M，Rat Anti-Mouse CD86 Antibody (FITC)(YA3447) 是一種大鼠來(lái)源、偶聯(lián)異硫氰酸熒光素 (FITC) 標(biāo)記、抗 CD86 的 IgG2a 單克隆抗體。

Anti-FMC63 scFv Antibody HY-P88054，Anti-FMC63 scFv Antibody 為抗獨(dú)特型抗體。FMC63 為 CD19 抗體，Anti-FMC63 scFv Antibody為抗 FMC63 scFv 抗體，因其能夠特異性結(jié)合 FMC63 scFv，表現(xiàn)出低背景，高特異性和強(qiáng)靈敏度，常被用于 FMC63 scFv 來(lái)源的 CAR 表達(dá)檢測(cè)。

FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG H&L HY-P80950，該抗體偶聯(lián)了熒光素 FITC、山羊來(lái)源、抗小鼠 IgG 抗體�？捎糜谛∈蟊尘跋� ICC/IF、FC 實(shí)驗(yàn)。

 

[1] Zand E et al. Potential of Flow Cytometric Approaches for Rapid Microbial Detection and Characterization in the Food Industry-A Review. Foods. 2021 Dec 15;10(12):3112.