腫瘤特異性激活的遮蔽型CART細胞在體內的抗腫瘤效果研究
本文來源于微信公眾： Of studies 作者： Of studies
嵌合抗原受體工程化T細胞（CAR-T）治療是一種強有力的癌癥免疫療法。CAR-T細胞可被重新定向，特異性識別腫瘤相關抗原（TAA），并誘導高水平的抗腫瘤活性。然而，由于TAA在健康組織中低水平表達，它們也可能引發(fā)“靶向腫瘤但脫靶正常組織on target off tumor”的毒性。這些不良反應已引起重大安全問題，并限制了這一原本前景廣闊的治療方式的臨床應用，遮蔽肽可能是免疫治療的下一個風口。
學習一篇很早的2017年發(fā)表在Molecular Therapy的文章，研究者給CART戴上面具，設計了一種針對表皮生長因子受體（EGFR）的遮蔽型CAR（masked CAR），其由一段遮蔽肽（可阻斷抗原結合位點）和一個蛋白酶敏感連接肽組成。腫瘤微環(huán)境中常見的蛋白酶可切割該連接肽，使遮蔽肽脫落，從而讓CAR-T細胞僅在腫瘤部位識別靶抗原。體外實驗顯示，在沒有蛋白酶的情況下，masked CAR的抗原結合能力和抗原特異性激活顯著降低；而在加入特定蛋白酶后，其結合與活性恢復至正常水平。遮蔽型CAR-T細胞在體內的抗腫瘤效果與未遮蔽CAR相當。
主要結果
1、EGFR CART的設計
編碼masked遮蔽肽序列：QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（源自Cetuximab probody 的抗原結合位點封閉肽）；
蛋白酶敏感 linker（可切）序列：GSSGGSGGSGGSG-LSGRSDNH-GSSGT；
蛋白酶底物序列LSGRSDNH是uPA/matriptase/legumain（在腫瘤微環(huán)境顯著上調的蛋白水解酶）的底物核心，兩側用 GS-rich 柔性鏈隔開。
非切割對照 linker（NSUB）序列：GSSGGSGGSGGSG-GGSGGGSG-GSSGT；
把酶底物序列 -LSGRSDNH- 換成了同長度、不可切的 GS 富集序列（8個氨基酸）：
2、CAR的表達和遮蔽情況
從人外周血單個核細胞（PBMCs）中分離出的細胞經(jīng)活化后，用不遮蔽、遮蔽和 NSUB 抗 EGFR 嵌合抗原受體（CAR）的逆轉錄病毒載體進行轉導，并在體外擴增10天。PL流式測 CAR 表面表達，rhEGFR-Fc 流式測結合能力
三組 CAR 表達率均 ≈ 30–35 %（無差異）；
結合率：Unmasked 35 % → Masked 3 % → NSUB 0.4 %；masked把結合力降到背景，說明遮蔽有效。
（A）用生物素化的蛋白 L 對三組 CAR-T 細胞進行染色，然后用 APC 標記的鏈霉親和素進行檢測，以檢測細胞表面的 CAR 表達情況。
（B）將 CAR-T 細胞與重組人 EGFR-Fc 蛋白孵育，然后用 PE 標記的山羊抗人 Fc 抗體進行染色，以評估 CAR 與其靶抗原人 EGFR 的結合能力。
3、蛋白酶處理后不同嵌合抗原受體（CAR）與靶抗原 EGFR 的結合情況
不遮蔽、遮蔽和 NSUB 抗 EGFR CAR-T 細胞經(jīng)不同濃度（0 nM、100 nM 和 400 nM）尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）處理后，用重組人 EGFR-Fc（rhEGFR-Fc）和山羊抗人 Fc 抗體進行染色，以評估蛋白酶處理對 CAR 與抗原結合的影響。
0 nM 時結合 6 %；100 nM 結合23 %；400 nM 結合 29 %（接近 Unmasked），結合恢復呈uPA劑量依賴， linker 被切。
4、不同靶細胞刺激下的各種 CAR-T 細胞的細胞內因子染色
在體外激活和擴增 10 天后，未修飾型、修飾型和 NSUB 型 CAR-T 細胞分別與 K562、K562-EGFR、MDA-MB-231 或 NCI-H292 細胞共培養(yǎng) 6 小時。未受刺激的 CAR-T 細胞用作陰性對照，而受抗 CD3/CD28 抗體刺激的 CAR-T 細胞用作陽性對照，通過細胞內染色測量干擾素γ（IFN-γ）的產(chǎn)生量。
K562-EGFR穩(wěn)定株高表達EGFR，但幾乎不分泌 uPA（尿激酶型纖溶酶原激活物-是一種絲氨酸蛋白酶），MDA-MB-231和NCI-H292高分泌uPA。
A圖為一個donor的代表性流式結果，B為3個donor定量數(shù)據(jù)。
Unmasked 對任何 EGFR⁺ 細胞均 15–20 % IFN-γ⁺；
Masked 對 K562-EGFR （無蛋白酶環(huán)境）僅 0.9 %（關閉狀態(tài)）；對 MDA231/H292 （分泌蛋白酶環(huán)境）升至 16–17 %（遮蔽型CART的linker裂解，打開EGFR結合點）；
NSUB 始終 < 7 %；
證明蛋白酶存在才能摘掉面具，“解鎖”T 細胞激活。
5、不同 CAR-T 細胞對不同靶細胞系的體外細胞毒性作用
CFSE 標記靶細胞 → 與 CAR-T 按 1:1–10:1 共孵 → 7-AAD 流式算存活率
- Unmasked 殺 K562-EGFR、231、H292 均高效；
- Masked 幾乎不殺 K562-EGFR（E:T=10 時僅 20 % 殺傷），但對 231 和 H292 殺傷可恢復至 Unmasked 水平；
- NSUB 殺傷始終低下；
體內外功能一致：腫瘤蛋白酶=殺傷開關。
（A）CAR-T 細胞以 1:1、3:1 或 10:1 的效應細胞與靶細胞比例與 K562-EGFR 細胞共培養(yǎng) 4 小時，然后測量對 K562-EGFR 細胞的細胞毒性。
（B）CAR-T 細胞以 1：1、3：1 或 10：1 的效應細胞與靶細胞比例與 NCI-H292 細胞共培養(yǎng) 18 小時，并測量細胞毒性。
（C）CAR-T 細胞以 1：1、2.5：1、5：1 或 10：1 的效應細胞與靶細胞比例與 MDA-MB-231 細胞共培養(yǎng) 18 小時，并測量細胞毒性。
6、CAR-T 細胞在人類肺癌異種移植模型中的抗腫瘤效果
NSG 鼠右脅皮下 NCI-H292 肺癌模型，12 d 后瘤≈120 mm³ → 隨機 4 組（n=8）,D13、D26 尾靜脈輸注 4×10⁶ CAR-T
Unmasked 與 Masked 均顯著受抑（p<0.05），兩組曲線重疊；NSUB 與對照無差異；Unmasked 中位 50.5 d，Masked 49 d；對照/NSUB 42 d（p<0.01）
遮蔽未削弱體內抗腫瘤效果，且安全性提升（無體重下降、皮膚/腸道毒性觀察）。
（A）體內 CAR-T 治療方案的示意圖。在第 0 天，將 NCI-H292 細胞注射到 NSG 小鼠的右側腹側。將小鼠隨機分為四組（每組 8 只），分別在第 13 天和第 26 天接受4E6 CAR-T 細胞的治療；未轉導的 T 細胞作為對照組。每周用卡尺測量腫瘤大小兩次。 （B）各組的腫瘤生長曲線。 （C）使用 Kaplan-Meier 法計算小鼠生存曲線。
附：
Cetuximab probody 是2013 年AbbVie在Science Translational Medicine報道的“前體抗體”（pro-antibody）版本 cetuximab，可理解為給原抗體加了一個可脫卸的“安全帽”，讓它在健康組織保持沉默，到達腫瘤后才被激活。
結構:重鏈 N 端額外融合了一段 12-14 aa 的“遮蔽肽”（masking peptide），遮蔽肽與重鏈之間插入一條腫瘤相關蛋白酶（uPA、matriptase 等）可切割的 linker。
作用機制：循環(huán)中：遮蔽肽折疊回來堵住 Fab 的 CDR 區(qū)，EGFR 結合力降低 50–500 倍，F(xiàn)c 功能也被抑制，幾乎不與正常組織 EGFR 結合。
腫瘤微環(huán)境：高濃度 uPA/matriptase 把 linker 切斷 → 遮蔽肽脫落 → 抗體“解鎖”，結合力恢復至母本 cetuximab （西妥昔單抗靶向EGFR）水平 → 照常阻斷 EGFR 信號并介導 ADCC/CDC。
小結
masked CAR在正常組織靜默，到腫瘤被蛋白酶掀開面具后才完全恢復結合-激活-殺傷活性，實現(xiàn)同等療效同時把正常組織on-target off-tumor風險壓到最低。這項早期研究證實了改善傳統(tǒng)CAR安全性的可行性，并可能為今后設計靶向廣泛表達TAA的CAR分子提供新思路。
