巨噬細(xì)胞來源的CXCL5在促進(jìn)胃癌化療抵抗中的作用機(jī)制研究

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（TME）中其他組分之間的相互作用，在化療抵抗發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 作為TME中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞群體，可通過分泌多種細(xì)胞因子與趨化因子，深刻影響腫瘤對治療的反應(yīng)。本研究旨在探討TAMs與胃癌細(xì)胞化療抵抗表型之間的相互作用，并揭示其核心分子機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)耐藥提供新思路。

二、巨噬細(xì)胞浸潤及M2極化在胃癌化療抵抗中的作用
首先，為探究巨噬細(xì)胞在胃癌中的分布特征及其與化療反應(yīng)的關(guān)系，研究者通過免疫組化檢測了接受5-FU新輔助化療患者組織標(biāo)本中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與病理反應(yīng)良好組相比，無病理反應(yīng)組組織中巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著增多，提示巨噬細(xì)胞在胃癌化療抵抗的發(fā)生與發(fā)展中可能具有重要作用。

為構(gòu)建體外化療抵抗模型，研究團(tuán)隊(duì)將親本胃癌細(xì)胞MKN45與HGC27長期暴露于濃度遞增的5-FU中，成功建立兩種5-FU耐藥細(xì)胞系MKN45-R與HGC27-R。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，5-FU能以劑量依賴方式抑制細(xì)胞活力。進(jìn)一步檢測顯示，耐藥細(xì)胞中化療抵抗相關(guān)蛋白P-gp與抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著升高，而促凋亡蛋白Bax則明顯下調(diào)。這些結(jié)果共同證實(shí)，通過持續(xù)藥物誘導(dǎo)可成功建立具有穩(wěn)定耐藥表型的胃癌細(xì)胞模型。

接下來，為模擬腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞與胃癌細(xì)胞間的相互作用，研究將人單核細(xì)胞系THP-1誘導(dǎo)分化為未極化巨噬細(xì)胞（M0），并分別與耐藥細(xì)胞（MKN45-R、HGC27-R）及其親本細(xì)胞進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)48小時(shí)，由此獲得源自5-FU敏感微環(huán)境（MS）和5-FU抵抗微環(huán)境（MR）的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（圖1A）。通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，與M0相比，MS與MR組中M1型相關(guān)基因（CD86、TNF-α、IL-12）表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，且MR組的下調(diào)程度顯著高于MS組（圖1B、C）。相反，M2型相關(guān)基因（CD163、CD206、IL-10、Arg-1、VEGF-A）表達(dá)則呈上調(diào)趨勢，且在MR組中表達(dá)水平顯著高于MS組（圖1B、C）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，與M0相比，MS與MR中M1型巨噬細(xì)胞比例降低，而M2型比例增高（圖1D）。

綜上，該部分實(shí)驗(yàn)表明，胃癌細(xì)胞具有調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2表型極化的能力，且化療抵抗細(xì)胞在此過程中表現(xiàn)出更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。這提示腫瘤細(xì)胞化療抵抗特性可能與微環(huán)境中M2型巨噬細(xì)胞的極化密切相關(guān)。

圖1    共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為 M2 表型。

三、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對胃癌細(xì)胞5-FU耐藥性的促進(jìn)作用
為探究不同表型巨噬細(xì)胞對胃癌細(xì)胞化療敏感性的影響，研究者在非接觸式共培養(yǎng)體系中，將胃癌細(xì)胞分別與不同來源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后，移除巨噬細(xì)胞并收集胃癌細(xì)胞進(jìn)行分析（圖2A）。通過CCK-8法檢測5-FU對胃癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）發(fā)現(xiàn)，與未共培養(yǎng)組相比，與MS及MR來源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)均能提高HGC27-S和MKN45-S細(xì)胞的IC₅₀值（圖2B、C）。進(jìn)一步比較顯示，MR巨噬細(xì)胞對胃癌細(xì)胞5-FU耐藥性的促進(jìn)作用顯著強(qiáng)于MS巨噬細(xì)胞（圖2D、E）。

為闡明其潛在機(jī)制，研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)或與MS巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞相比，與MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞凋亡率顯著降低（圖2F、G）。Western blot分析進(jìn)一步表明，與MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，胃癌細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白P-gp及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)則明顯下調(diào)（圖2H、I）。

綜合以上結(jié)果可得出結(jié)論：5-FU耐藥性胃癌細(xì)胞能夠有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，而此類M2型巨噬細(xì)胞可進(jìn)一步通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對5-FU的化療抵抗能力，形成促進(jìn)耐藥的正反饋環(huán)路。

圖2    共培養(yǎng)M2極化的巨噬細(xì)胞增強(qiáng)胃癌細(xì)胞5- Fu抵抗性。

四、M2型巨噬細(xì)胞通過分泌CXCL5激活PI3K/AKT/mTOR通路增強(qiáng)胃癌細(xì)胞5-FU耐藥
基于前期觀察到的不同巨噬細(xì)胞亞型對胃癌細(xì)胞耐藥性影響的差異，研究人員推測其可能與分泌細(xì)胞因子的水平不同相關(guān)。為此，通過RT-qPCR對11種常見細(xì)胞因子進(jìn)行篩選分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有CCL18與CXCL5的表達(dá)變化趨勢與前述功能表型相符。由于CXCL5在MS與MR巨噬細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CCL18，研究選擇CXCL5作為后續(xù)重點(diǎn)研究對象，以驗(yàn)證其在介導(dǎo)胃癌細(xì)胞5-FU耐藥中的作用。

為明確CXCL5的功能，研究者分別使用重組人CXCL5蛋白（rhCXCL5）或CXCL5中和抗體處理5-FU敏感型胃癌細(xì)胞，并在單獨(dú)培養(yǎng)或與MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，評估細(xì)胞對不同濃度5-FU的敏感性。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)或添加rhCXCL5均可顯著提高胃癌細(xì)胞的5-FU耐受性；而使用CXCL5中和抗體則可有效逆轉(zhuǎn)由MR巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的耐藥增強(qiáng)效應(yīng)。上述結(jié)果提示，M2極化巨噬細(xì)胞來源的CXCL5是參與調(diào)控胃癌細(xì)胞5-FU耐藥的關(guān)鍵趨化因子。

目前研究普遍認(rèn)為，細(xì)胞凋亡抵抗是導(dǎo)致化療耐藥的重要原因之一，而5-FU的主要抗腫瘤機(jī)制正是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了M2型巨噬細(xì)胞是否通過調(diào)控凋亡途徑介導(dǎo)5-FU耐藥。凋亡檢測顯示，與MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)或添加rhCXCL5均可顯著降低胃癌細(xì)胞的凋亡比例，而CXCL5中和抗體則能削弱MR巨噬細(xì)胞對凋亡的抑制作用（圖3A、B）。Western blot分析進(jìn)一步表明，MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)或外源性rhCXCL5處理均可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)、下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)；而CXCL5中和抗體則能顯著逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)變化（圖3C、D）。

已有研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及化療抵抗中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步闡明其在該過程中的作用，研究者檢測了該通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)或添加rhCXCL5均可顯著提升磷酸化PI3K、AKT及mTOR的表達(dá)水平，而使用CXCL5中和抗體則可明顯抑制該通路的激活。

綜合以上結(jié)果表明，M2型巨噬細(xì)胞通過分泌CXCL5，可有效激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，抑制胃癌細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)其對5-FU的化療抵抗能力。

圖3     M2極化的巨噬細(xì)胞通過激活胃癌細(xì)胞CXCL5/PI3K/AKT/mTOR通路抑制細(xì)胞凋亡，增加5-Fu耐藥性。

圖4    CXCL5在胃癌組織中的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。（C）顯示巨噬細(xì)胞如何與胃癌細(xì)胞相互作用以促進(jìn)胃癌化療抵抗微環(huán)境發(fā)展的圖形摘要。

六、研究總結(jié)與轉(zhuǎn)化意義：靶向TAMs-CXCL5軸作為逆轉(zhuǎn)胃癌化療抵抗的潛在策略
綜上所述，本研究揭示化療抵抗性胃癌細(xì)胞能夠更有效地誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，而此類M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）又可進(jìn)一步強(qiáng)化胃癌細(xì)胞的化療抵抗能力，從而在TAMs與胃癌細(xì)胞之間形成自我維持的正反饋環(huán)路（圖4C）。在這一相互作用中，TAMs來源的CXCL5發(fā)揮核心介導(dǎo)作用：一方面，CXCL5可募集外周單核細(xì)胞并在腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)其分化為M2型巨噬細(xì)胞；另一方面，CXCL5通過激活胃癌細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT/mTOR信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)其對5-FU的化療抵抗性。

這些結(jié)果表明，針對TAMs的調(diào)控及阻斷TAMs與胃癌細(xì)胞之間的相互作用，可能成為逆轉(zhuǎn)化療抵抗、改善患者預(yù)后的潛在治療方向。具體而言，靶向CXCL5信號軸或干預(yù)PI3K/AKT/mTOR通路，有望打破TAMs與腫瘤細(xì)胞間的惡性循環(huán)，為臨床治療化療抵抗性胃癌提供新的策略。

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