蛋白酶抑制劑Cocktail的IP實(shí)驗(yàn)、WB實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)

蛋白酶抑制劑 Cocktail (EDTA-Free, 100× in DMSO) 可以用于細(xì)胞或組織提取物用來增加蛋白穩(wěn)定性。在穩(wěn)定環(huán)境下內(nèi)源性蛋白的產(chǎn)生和降解通常處于動(dòng)態(tài)平衡，在細(xì)胞水平上趨于穩(wěn)定。而在體外研究中，蛋白的降解風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加，為防止蛋白降解，可以添加小分子抑制劑來阻斷蛋白降解，貨號(hào)：HY-K0010（點(diǎn)擊跳轉(zhuǎn)官網(wǎng)了解詳情）。

蛋白酶抑制劑 Cocktail (EDTA-Free, 100× in DMSO) 由 6 種蛋白酶抑制劑混合制成，用于保護(hù)蛋白的完整性。可用于蛋白質(zhì)免疫分析 (WB)、免疫沉淀 (IP)、免疫共沉淀 (Co-IP)、pull-down、免疫組織化學(xué) (IHC)、免疫熒光 (IF)、激酶研究等多種分析。

價(jià)格比較
 
 
操作流程

蛋白酶抑制劑使用前需在室溫下解凍，按照 1:100 (v/v) 的比例將該抑制劑混合物加入到裂解液中，混勻即可。

IP實(shí)驗(yàn)、WB實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)

1、Neuro Oncol. 2024 Aug 2:noae147. doi: 10.1093/neuonc/noae147.
腫瘤微環(huán)境中低水平的腫瘤壞死因子α維持了 Vasorin 介導(dǎo)的糖酵解對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新

在T4121和WF19 GSCs中共同免疫沉淀TNFR1或VASN，并對(duì)TNFR1和VASN進(jìn)行免疫印跡。IgG被用作IP的對(duì)照抗體。

背景： 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞 （GSC） 的自我更新是導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 （GBM） 治療耐藥和復(fù)發(fā)的原因。腫瘤壞死因子 α （TNFα） 和 TNF 信號(hào)通路在臨床前模型和腫瘤患者中顯示出抗腫瘤活性。然而，根據(jù)膠質(zhì)瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，TNFα對(duì)膠質(zhì)瘤臨床預(yù)后沒有意義。本研究旨在探討腫瘤微環(huán)境的 TNFα是否能維持 GSCs 的自我更新，促進(jìn)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較差。

方法： 采用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)、免疫印跡、球體形成試驗(yàn)、極限稀釋和基因表達(dá)分析來確定 TNFα對(duì) GSC 自我更新的作用。采用質(zhì)譜、RNA 測(cè)序檢測(cè)、生物信息學(xué)分析、qRT-RNA、免疫熒光、免疫組化、單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 、體外和體內(nèi)模型等手段，揭示了 TNFα誘導(dǎo)的 GSC 自我更新機(jī)制。

結(jié)果： 低水平的 TNFα 對(duì) GSC 自我更新和更差的神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后具有促進(jìn)作用。在機(jī)制上，Vasorin （VASN） 通過增強(qiáng)糖酵解介導(dǎo) TNFα 誘導(dǎo)的自我更新。糖酵解產(chǎn)生的乳酸抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的 TNFα分泌，并將 TNFα維持在較低水平。

結(jié)論： VASN 介導(dǎo)的 TNFα誘導(dǎo)的 GSC 自我更新為內(nèi)源性 TNFα效應(yīng)對(duì) GBM 的失敗提供了可能的解釋。靶向 VASN 和 TNFα抗腫瘤作用相結(jié)合可能是治療 GBM 的有效方法。

2、Mol Cancer. 2024 Apr 4;23(1):70. doi: 10.1186/s12943-024-01985-1.
標(biāo)題：治療誘導(dǎo)的衰老腫瘤細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡通過 SERPINE1 介導(dǎo)的 NF-κB p65 核易位促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展

全細(xì)胞裂解物和 EV 中 EVs 標(biāo)志物和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物的蛋白質(zhì)印跡分析。

 
背景： 細(xì)胞衰老在抗癌治療過程中經(jīng)常發(fā)生，持續(xù)性衰老腫瘤細(xì)胞 （STC） 通過衰老相關(guān)分泌表型 （SASP） 的旁分泌不利地促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。細(xì)胞外囊泡 （EV） 最近作為 SASP 的新組成部分出現(xiàn)，主要介導(dǎo) SASP 的腫瘤促進(jìn)作用。值得注意的是，STC 釋放的 EV 對(duì)腫瘤進(jìn)展的潛在影響在很大程度上仍然未知。

方法： 我們收集了兩組結(jié)直腸癌 （CRC）患者的腫瘤組織，以檢查抗癌治療前后 p16、p21 和 SERPINE1 的表達(dá)。隊(duì)列 1 包括 22 名在手術(shù)切除前接受新輔助治療的局部晚期直腸癌 （LARC） 患者。隊(duì)列 2 包括 30 名接受一線含伊立替康治療的轉(zhuǎn)移性 CRC （mCRC） 患者。通過 CCK-8、transwell、傷口愈合試驗(yàn)和腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)，確定 STC 釋放的 EVs 對(duì) CRC 進(jìn)展的影響。采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定 STCs 分泌的 EVs 內(nèi)蛋白質(zhì)貨物，利用免疫沉淀和質(zhì)譜儀鑒定來探索 SERPINE1 的結(jié)合伙伴。通過免疫共沉淀驗(yàn)證了 SERPINE1 與 p65 的相互作用，并通過免疫熒光證實(shí)了它們的共定位。

結(jié)果： 化療藥物和輻照可以在體外和人 CRC 組織中有效誘導(dǎo) CRC 細(xì)胞衰老。抗癌治療后患者 p16 和 p21 表達(dá)的更顯著升高顯示出 LARC 的無病生存期 （DFS） 或 mCRC 的無進(jìn)展生存期 （PFS） 較短。我們觀察到，與非 STC 相比，STC 釋放的富含 SERPINE1 的 EV 數(shù)量增加，這進(jìn)一步促進(jìn)了受體癌細(xì)胞的進(jìn)展。用特異性抑制劑替普拉施汀靶向 SERPINE1，顯著減弱了 STCs 衍生的 EV 的腫瘤促進(jìn)作用。此外，抗癌治療后 SERPINE1 表達(dá)增加較多的患者，LARC 的 DFS 或 mCRC 的 PFS 較短。從機(jī)制上講，SERPINE1 與 p65 結(jié)合，促進(jìn)其核易位并隨后激活 NF-κB 信號(hào)通路。

結(jié)論： 我們提供了治療誘導(dǎo)的衰老的臨床預(yù)后意義的體內(nèi)證據(jù)。我們的結(jié)果表明，STC 通過產(chǎn)生大量富含 SERPINE1 的 EV 來導(dǎo)致 CRC 進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了治療誘導(dǎo)的衰老在腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，并為 CRC 治療提供了潛在的治療策略。

3、Cell Mol Immunol. 2024 Aug 20. doi: 10.1038/s41423-024-01203-4.
標(biāo)題：工程線粒體作為癌癥疫苗平臺(tái)發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤免疫作用

在蛋白酶抑制劑混合物（HY-K0010）和磷酸酶抑制劑混合物 II（HY-K0022）存在下，用 RIPA 緩沖液裂解 cels，煮沸 10 min。
B16-F10 細(xì)胞線粒體中 OVA 或 TRP2 水平的免疫印跡分析，或用攜帶線粒體的模型抗原（OVA 或 TRP2）構(gòu)建穩(wěn)定的 B16-F10 細(xì)胞系�？� VDAC1 用作負(fù)載控制。

 
優(yōu)選的抗原遞送譜伴有足夠的佐劑有利于疫苗效率。線粒體具有原核特征并含有各種損傷相關(guān)分子模式 （DAMP），很容易被吞噬細(xì)胞吸收并同時(shí)激活先天免疫。

在目前的研究中，我們建立了一個(gè)線粒體工程平臺(tái)，用于生成富含抗原的線粒體作為癌癥疫苗。以卵清蛋白（OVA）和酪氨酸酶相關(guān)蛋白 2（TRP2）為模型抗原，與線粒體定位信號(hào)肽合成融合蛋白。然后采用慢病毒感染系統(tǒng)生產(chǎn)含有 OVA 或 TRP2 的線粒體疫苗。

提取了含有 OVA 和 TRP2 的工程線粒體（OVA-MITO 和 TRP2-MITO）并評(píng)估為潛在的癌癥疫苗。令人印象深刻的是，工程化線粒體疫苗在小鼠腫瘤模型中用作預(yù)防和治療疫苗時(shí)顯示出有效的抗腫瘤作用。

在機(jī)制上，OVA-MITO 和 TRP2-MITO 有效招募和激活樹突狀細(xì)胞 （DC），并誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。此外，線粒體疫苗對(duì) DC 的激活關(guān)鍵涉及 TLR2 通路及其脂質(zhì)激動(dòng)劑，即源自線粒體膜的心磷脂。

結(jié)果表明，工程化線粒體是天生精心編排的載體，充滿了抗原遞送的免疫刺激劑，可以更優(yōu)選地靶向局部樹突狀細(xì)胞并發(fā)揮強(qiáng)大的適應(yīng)性細(xì)胞免疫。這項(xiàng)概念驗(yàn)證研究建立了一個(gè)通用的疫苗構(gòu)建平臺(tái)，該平臺(tái)具有攜帶癌癥和其他疾病可改變抗原的工程線粒體。