R-spondin-1高活性Wnt通路激活劑在多種類器官/干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

R-spondin-1（RSPO1）作為 R-spondin 家族中的重要成員，是一類分泌性蛋白，在生物體內(nèi)發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用。RSPO1（重組人R-spondin 1/RSPO1蛋白, AbMole，M15009）是通過基因工程技術(shù)在異源系統(tǒng)中表達(dá)的高純度功能性蛋白，已成為研究Wnt信號(hào)以及在干細(xì)胞、類器官培養(yǎng)中不可或缺的重要工具。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、靶點(diǎn)蛋白、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專利引用。

一、R-spondin-1（RSPO1）的生物學(xué)功能
RSPO1（重組人R-spondin 1/RSPO1蛋白, AbMole，M15009）是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的重要激活劑。它主要通過與富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體（LGR4-6，即 LGR4、LGR5或LGR6）結(jié)合來發(fā)揮作用。當(dāng) RSPO1與LGR4-6結(jié)合后，可觸發(fā)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，促使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF結(jié)合，進(jìn)而增加靶基因的表達(dá)。例如，在小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，給予外源性的RSPO1后，能檢測到非磷酸化 β-catenin水平顯著升高，同時(shí)Lgr5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量也增加，這證實(shí)了RSPO1對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的激活，并且提示其在維持相關(guān)干細(xì)胞微環(huán)境及干性方面的作用^[1]。除了經(jīng)典途徑，RSPO1在非經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路中也發(fā)揮作用。有研究認(rèn)為它可能通過作為鋅指蛋白 RNF43（一種重要的 Wnt 信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子）的抑制劑來調(diào)控非經(jīng)典Wnt信號(hào)。RNF43能夠促進(jìn)Frizzled受體的泛素化和降解，而 RSPO1可以抑制RNF43的這種作用，使得Frizzled受體能夠持續(xù)發(fā)揮功能，從而參與非經(jīng)典 Wnt 信號(hào)的調(diào)節(jié)^[2]。

二、R-spondin-1（RSPO1）在干細(xì)胞生物學(xué)與類器官技術(shù)中的應(yīng)用
RSPO1（重組人R-spondin 1/RSPO1蛋白, AbMole，M15009）通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在維持干細(xì)胞自我更新、促進(jìn)組織穩(wěn)態(tài)及類器官構(gòu)建中發(fā)揮著極其重要的作用。在腸道上皮干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，添加 RSPO1 能夠有效促進(jìn)這些干細(xì)胞的增殖，維持其干性。除此之外，R-spondin-1還可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞的定向分化，通過梯度添加RSPO1，促進(jìn)中內(nèi)胚層分化（如肝細(xì)胞、胰腺前體細(xì)胞）^{[3, 4]}。

1. R-spondin-1（RSPO1）用于腸道類器官的培養(yǎng)
RSPO1（重組人R-spondin 1/RSPO1蛋白, AbMole，M15009）是多種類器官培養(yǎng)體系的核心組分。在經(jīng)典腸道類器官培養(yǎng)基中，RSPO1與Wnt3a和EGF 共同模擬腸道干細(xì)胞微環(huán)境的關(guān)鍵信號(hào)。研究表明，添加重組RSPO1能夠激活經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路，促使腸道干細(xì)胞大量增殖，顯著提高腸道類器官的形成效率和生長速度^[5]。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將小鼠腸道隱窩分離出來進(jìn)行體外培養(yǎng)，在含有重組人 RSPO1 的培養(yǎng)基中，腸道隱窩能夠迅速增殖并形成結(jié)構(gòu)完整的腸道類器官，類器官內(nèi)包含腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，并且能夠長期維持穩(wěn)定的生長和分化狀態(tài)。而在缺乏重組RSPO1的對(duì)照組中，腸道隱窩的增殖能力明顯受限，難以形成成熟的類器官結(jié)構(gòu)^[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，重組人 RSPO1 通過與腸道干細(xì)胞表面的 LGR4-6受體結(jié)合，抑制 RNF43 對(duì) Frizzled 受體的泛素化降解，從而持續(xù)激活Wnt信號(hào)，為腸道干細(xì)胞提供了必要的生存和增殖信號(hào)，維持了腸道類器官中干細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)定^[6]。這種體外培養(yǎng)技術(shù)的突破極大推動(dòng)了組織發(fā)育、疾病建模和藥物篩選等領(lǐng)域的發(fā)展。
2. R-spondin-1（RSPO1）用于肝臟類器官的培養(yǎng)
對(duì)于肝臟類器官的培養(yǎng)，RSPO1（重組人R-spondin 1/RSPO1蛋白, AbMole，M15009）同樣具有重要作用。在肝臟發(fā)育過程中，肝祖細(xì)胞的增殖和分化受到多種信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控。重組RSPO1可以通過激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)肝祖細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化，提高肝臟類器官中功能性肝細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)表明，在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向肝臟類器官分化的過程中，添加重組RSPO1能夠顯著上調(diào)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物如白蛋白（Albumin）、細(xì)胞色素 P450 家族成員等的表達(dá)水平，同時(shí)增強(qiáng)肝臟類器官的代謝功能，如對(duì)化合物的代謝能力和解毒能力。這是因?yàn)橹亟MRSPO1（R-spondin-1）蛋白激活的 Wnt 信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)一系列與肝臟發(fā)育和功能相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)促進(jìn)肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，進(jìn)而提高肝臟類器官的質(zhì)量和功能完整性，為研究肝臟疾病發(fā)病機(jī)制、化合物肝毒性測試等提供更有效的體外模型。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學(xué)用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

3. R-spondin-1（RSPO1）用于毛囊類器官的培養(yǎng)
在毛囊類器官研究方面，RSPO1（重組人R-spondin 1/RSPO1蛋白, AbMole，M15009）對(duì)毛囊類器官的發(fā)育和成熟具有顯著的促進(jìn)作用。毛囊類器官是由表皮干細(xì)胞和真皮間充質(zhì)干細(xì)胞在特定三維環(huán)境中共同培養(yǎng)形成的，能夠模擬毛囊在體內(nèi)的生長和發(fā)育過程。研究發(fā)現(xiàn)，在毛囊類器官培養(yǎng)體系中加入重組R-spondin-1蛋白后，毛囊類器官的發(fā)芽率顯著提高，可從原本的 62.7% 提升至 90.0%。在顯微鏡下觀察，經(jīng)重組人 RSPO1 處理的毛囊類器官形態(tài)更加規(guī)則，并且長出了類似頭發(fā)的結(jié)構(gòu)，而未處理組則無明顯變化。深入研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，重組RSPO1（R-spondin-1）蛋白通過激活 Wnt信號(hào)通路，同時(shí)上調(diào)與毛囊再生相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)，如堿性磷酸酶（ALP）、Versican 和 β-catenin 等，還能夠激活PI3K-Akt、Rap1、NF-κB 等多個(gè)與毛囊形態(tài)發(fā)生和發(fā)芽密切相關(guān)的信號(hào)通路，全方位促進(jìn)毛囊類器官的發(fā)育和成熟，為脫發(fā)等毛發(fā)相關(guān)疾病的研究提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)^[7]。

4. R-spondin-1（RSPO1）用于其它類器官的培養(yǎng)
除了上述常見的類器官類型，在胰腺類器官、肺類器官等的研究中，重組RSPO1也逐漸顯示出重要作用。在胰腺類器官培養(yǎng)中，重組 RSPO1有助于維持胰腺祖細(xì)胞的干性，促進(jìn)其增殖和分化為胰島細(xì)胞等功能細(xì)胞，對(duì)于研究胰腺發(fā)育具有潛在價(jià)值^[8]。在肺類器官培養(yǎng)過程中，添加重組RSPO1能夠調(diào)節(jié)肺干細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)肺類器官形成更接近體內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的肺泡等結(jié)構(gòu)，為肺部疾病的研究和相關(guān)藥敏篩選提供了更便捷的模型^[8]。

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參考文獻(xiàn)及鳴謝
[1] 陳晨, 李筠, 劉云章, et al., R-spondin:一個(gè)新的Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白家族的研究進(jìn)展, 23(4) (2011) 9.
[2] P. H. Chen, X. Chen, Z. Lin, et al., The structural basis of R-spondin recognition by LGR5 and RNF43, Genes & development 27(12) (2013) 1345-50.
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[4] P. Bhanja, S. Saha, R. Kabarriti, et al., Protective role of R-spondin1, an intestinal stem cell growth factor, against radiation-induced gastrointestinal syndrome in mice, PloS one 4(11) (2009) e8014.
[5] 強(qiáng)龍征, 毛海光, 王夢(mèng)婷, et al., 腸道類器官在腸疾病機(jī)制研究中的運(yùn)用, (002) (2024) 051.
[6] Toshiro Sato, Robert G. Vries, Hugo J. Snippert, et al., Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche, 459(7244) (2009) 262-265.
[7] E. L. Weber, Y. C. Lai, M. Lei, et al., Human Fetal Scalp Dermal Papilla Enriched Genes and the Role of R-Spondin-1 in the Restoration of Hair Neogenesis in Adult Mouse Cells, Frontiers in cell and developmental biology 8 (2020) 583434.
[8] M. Dossena, R. Piras, A. Cherubini, et al., Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids, Stem cell research & therapy 11(1) (2020) 94.