文章分享：由STYK1驅(qū)動的胰腺癌進(jìn)展新機(jī)制和治療新靶點(diǎn)研究
Wnt/β-catenin信號通路是一條在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、組織再生及腫瘤發(fā)生中高度保守的信號通路，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在胰腺癌中Wnt/β-catenin信號通路持續(xù)激活，導(dǎo)致不良預(yù)后以及癌癥相關(guān)死亡率升高，推動腫瘤的快速發(fā)展。Wnt/β-catenin信號通路通路為何失控加速，持續(xù)激活？近日，湖北工業(yè)大學(xué)唐景峰教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Signal Transduction and Targeted Therapy的文章揭示了其內(nèi)在機(jī)制。
在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)了一個重要的靶標(biāo)STYK1，并探究了STYK1在調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路及胰腺癌腫瘤發(fā)生中的作用。研究結(jié)果表明，STYK1可直接與β-catenin和GSK3β結(jié)合，抑制GSK3β的活性，并促進(jìn)其進(jìn)入多囊泡體（MVBs）中。BLK激酶對STYK1的Y191位點(diǎn)磷酸化，增強(qiáng)其與AP2的相互作用，從而加速GSK3β隔離至MBVs，使其失去對β-catenin的抑制作用，并隨后激活Wnt/β-catenin通路。這些結(jié)果共同揭示了在胰腺癌中一種由STYK1驅(qū)動的Wnt/β-catenin激活的新機(jī)制，并為將STYK1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作為治療策略提供了臨床前證據(jù)。
文章總體思路
作者的研究思路如下：
首先研究團(tuán)隊(duì)通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)STYK1在多種人類癌癥中普遍高表達(dá)，在胰腺癌中尤為顯著。通過對多個公共數(shù)據(jù)庫，患者胰腺癌組織微陣列，PDAC模型小鼠進(jìn)一步分析，表明STYK1的表達(dá)水平與PDAC（胰腺導(dǎo)管腺癌）的進(jìn)展平行階段性增強(qiáng)。在小鼠腫瘤異種移植瘤模型中敲除STYK1后，腫瘤生長相較于對照組明顯減弱。
Fig 1. SRYK1在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，STYK1敲除減緩胰腺癌進(jìn)程
為了深入闡明STYK1在胰腺癌腫瘤發(fā)生中的分子機(jī)制，作者對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染STYK1 shRNA的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行全基因組RNA測序。基因本體（Gene Ontology)富集分析顯示，STYK1的缺失會改變Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控，而這一通路被認(rèn)為與胰腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)。在AsPC-1和PANC-1這兩種胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）模型中，TOPflash/FOPflash雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)顯示，STYK1缺失可顯著抑制β-catenin的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性以及Wnt3a刺激所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。而STYK1過表達(dá)可增強(qiáng)β-catenin在核內(nèi)的積累。這些結(jié)果表明，STYK1通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而調(diào)節(jié)胰腺癌進(jìn)展。
Fig.2 STYK1促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路激活
部分相關(guān)熱賣產(chǎn)品
| 貨號 | 名稱 | 應(yīng)用 |
| 9561 | Phospho-beta-Catenin (Ser33/37/Thr41) Antibody | WB抗體 |
| 8480 | β-Catenin (D10A8) XP® Rabbit mAb | WB抗體 |
| 2978 | Cyclin D1 (92G2) Rabbit mAb | WB抗體 |
| 2151 | Axin2 (76G6) Rabbit mAb | WB抗體 |
為了進(jìn)一步探討STYK1在調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路中的機(jī)制，作者構(gòu)建表達(dá)STYK1相關(guān)蛋白復(fù)合物進(jìn)行親和純化。隨后通過LC-MS/MS分析，鑒定出GSK3β和β-catenin為主要相互作用蛋白，表明STYK1通過調(diào)節(jié)β-catenin降解復(fù)合體的活性參與Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控。通過CO-IP，免疫熒光，GST-pull down等多重驗(yàn)證，結(jié)果均表明STYK1和GSK3β、β-catenin有相互作用。CHX追蹤實(shí)驗(yàn)表明STYK1過表達(dá)顯著抑制β-catenin的降解。
Fig.3 STYK1和GSK3β、β-catenin具有相互作用
部分相關(guān)熱賣產(chǎn)品
| 貨號 | 名稱 | 應(yīng)用 |
| 17075601 | GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B 10 ML | GST瓊脂糖樹脂 |
| 9315 | GSK-3β (27C10) Rabbit mAb | WB抗體 |
| abs9649 | Co-IP試劑盒 | Co-IP試劑盒 |
| S0B0271 | S-RMab® GST Tag Recombinant Rabbit mAb (S-372-19) | GST標(biāo)簽抗體 |
接下里，作者進(jìn)一步研究STYK1和GSK3β、β-catenin之間的作用機(jī)理。先前的研究發(fā)現(xiàn)，STYK1 部分定位于細(xì)胞膜，胞內(nèi)部分則與 Rab5 或 Rab7 陽性（Rab5⁺/Rab7⁺）多囊泡體（MVBs）共定位，而這些MVBs與 GSK3β 的隔離有關(guān)。因此，作者猜測STYK1會影響MVBs對GSK3β 的隔離。因此，作者構(gòu)建了一個Rab5 Q79L突變體以誘導(dǎo)形成擴(kuò)大的晚期內(nèi)體囊腔，并分析了Rab5 Q79L表達(dá)細(xì)胞中GSK3β的亞細(xì)胞分布。結(jié)果表明，Wnt3a會顯著促進(jìn)GSK3β進(jìn)入MVBs中，而STYK1的缺失會逆轉(zhuǎn)這一過程。
Fig.4 Wnt3a會顯著促進(jìn)GSK3β進(jìn)入MVBs中，而STYK1的缺失會逆轉(zhuǎn)這一過程。
為探究 STYK1-β-catenin 或 STYK1-GSK3β 相互作用在 GSK3β 隔離及其后續(xù) Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)中的作用，作者設(shè)計了能夠特異性破壞 STYK1 與 β-catenin 或GSK3β 結(jié)合的短肽，并通過Biacore實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其效果。接下來，作者檢測這些短肽對于GSK3β以及Wnt/β-catenin信號通路的影響。結(jié)果表明，這些短肽抑制GSK3β進(jìn)入MVBs，并促進(jìn)了GSK3β, Axin1, and β-catenin之間的相互作用以及隨后β-catenin的降解。這些結(jié)果表明，STYK1 -β-catenin或STYK1-GSK3β相互作用對于STYK1介導(dǎo)的GSK3β隔離和隨后的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)激活至關(guān)重要。進(jìn)一步的研究也表明這些阻斷肽會抑制移植瘤的生長，增加腫瘤異種移植瘤小鼠的生存期。
Fig.5 活性短肽抑制GSK3β進(jìn)入MVBs，并促進(jìn)了GSK3β, Axin1, and β-catenin之間的相互作用以及隨后β-catenin的降解。
部分相關(guān)熱賣產(chǎn)品
| 貨號 | 名稱 | 應(yīng)用 |
| BR100530 | Series S Sensor Chip CM5 | Biacore CM5芯片 |
| 10600023 | 0.45UM PVDF 300MMx4M 1/PK | 轉(zhuǎn)印膜 |
| abs817874 | MG-132 | 蛋白酶體抑制劑 |
| 2568 | Phospho-LRP6 (Ser1490) Antibody | WB抗體 |
綜上，作者通過多種體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)STYK1的高表達(dá)與胰腺癌生存率低有關(guān)，并且
STYK1缺失抑制胰腺癌細(xì)胞的生長。此外，作者還闡明了STYK1通過與GSK3β和β-catenin結(jié)合來激活Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)的作用。clathrin/ AP2介導(dǎo)的STYK1內(nèi)化和GSK3β隔離在β-catenin復(fù)合體的失活和隨后的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。
在疾病機(jī)制研究中，蛋白作為生命活動的關(guān)鍵分子，其功能和相互作用在疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演者重要的作用。因此，深入研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，對于揭示疾病發(fā)生，通路機(jī)制以及研發(fā)有效的治療策略具有重要的意義。在這一過程中，蛋白純化是不可或缺的關(guān)鍵步驟。掌握成熟的純化方法并得到足量的高純度高活性的蛋白，無論是對于蛋白功能，相互作用，或者蛋白結(jié)構(gòu)研究都非常重要。
以本文的STYK1蛋白純化方法為例，原核表達(dá)體系蛋白純化可以按照以下的步驟進(jìn)行（具體操作視頻點(diǎn)擊查看https://www.univ-bio.com/study-center/solution/Technology/PPP.html）：
1、質(zhì)粒構(gòu)建
在NCBI上查找STYK1 ICD序列（aa 26-422），設(shè)計引物PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因片段；將目標(biāo)片段和克隆載體pGEX4T-1（如果是His標(biāo)簽，可以選擇pET-28a克隆載體）分別使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并使用T4連接酶進(jìn)行連接。
構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli TOP 10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增和鑒定，鑒定后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli strain BL21 (DE3)進(jìn)行表達(dá)。
2、蛋白表達(dá)
包含重組質(zhì)粒的E. coli strain BL21 (DE3)菌株接種到5ml包含70 μg/ml ampicillin的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)。過夜的培養(yǎng)基接種到50ml包含70 μg/ml ampicillin(diluted 1:100)的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600 =0.4–0.6。
加入0.2 mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)37℃，5h。大腸桿菌菌體通過離心收集（12,000g for 3 min），細(xì)胞沉淀用裂解液進(jìn)行重懸，然后冰上超聲100次（sonicated 5 s with 5 s intervals between each pulse）。
30,000g 離心30 min，取上清用0.45μm濾膜過濾。
3、蛋白純化
GST標(biāo)簽：
結(jié)合緩沖液：PBS, pH7.3
洗脫緩沖液：50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione,pH 8.0
His標(biāo)簽：
結(jié)合緩沖液：20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl，20 to 40 mM imidazole, pH 7.4
洗脫緩沖液：20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4
潤洗濾膜并放入重力空柱中，加入1ml GST填料用結(jié)合緩沖液平衡3次。加入2ml結(jié)合緩沖液到填料中重懸制備填料懸液，然后將樣品和填料懸液混合，并放入離心管中搖晃孵育1-2h。
將樣品和填料懸液混合物倒入層析空柱，將層析柱豎直放置在試管架上。加入5ml結(jié)合緩沖液洗雜。
加入3-5ml洗脫緩沖液進(jìn)行目標(biāo)蛋白洗脫，收集流出液。收集物使用SDS-PAGE跑膠鑒定。
相關(guān)熱賣產(chǎn)品
多組學(xué)初篩
| 貨號 | 名稱 |
| LXBWTA00-1 | 超高通量單細(xì)胞WTA測序 |
| LXBWTA01-1 | 單細(xì)胞WTA測序 |
| LX-DSP | DSP空間多組學(xué)實(shí)驗(yàn)服務(wù) |
細(xì)胞造模
| 貨號 | 名稱 |
| abs9331 | Trizol(總RNA抽提試劑盒) |
| abs60296 | 小量高純?nèi)?nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒 |
| 301105 | PolyFect Transfection Reagent |
| SH30406.05 | New Zealand Characterized Foetal Bovine Serum |
| SV30208.02 | Australian FBS, 500ML |
| abs972 | 胎牛血清(優(yōu)級) |
| Abs42024900 | 百日咳毒素 |
| Abs9270 | 弗氏完全佐劑 |
| Abs9490 | 基質(zhì)膠（標(biāo)準(zhǔn)型，含酚紅） |
| Abs9447 | 人胰腺癌類器官培養(yǎng)試劑盒 |
表型/功能檢測
| 貨號 | 名稱 |
| Abs580002 | 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)檢測試劑盒 |
| Abs580117 | ATP Microplate Assay Kit |
| Abs50001 | Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 |
| Abs50003 | CCK-8試劑盒 |
| Abs580085 | 甘油三酯（TG）檢測試劑盒 |
| Abs580042 | 谷胱甘肽還原酶檢測試劑盒 |
信號通路篩選
| 貨號 | 名稱 |
| 2915 | Wnt Signaling Antibody Sampler Kit |
| 9910 | Phospho-MAPK Family Antibody Sampler Kit |
| 9915 | Apoptosis Antibody Sampler Kit |
| 9916 | Phospho-Akt Pathway Antibody Sampler Kit |
| 10600023 | 0.45UM PVDF 300MMx4M 1/PK |
| 10600002 | NC 0.45UM 300MMx4M 1/PK |
| Abs920 | ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒 |
| abs9299 | 一抗二抗稀釋液 |
檢測驗(yàn)證
| 貨號 | 名稱 |
| 8480 | β-Catenin (D10A8) XP Rabbit mAb |
| 9561 | Phospho- β-Catenin (Ser33/37/Thr41) Antibody |
| 9664 | Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb |
| 4060 | Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP Rabbit mAb |
| 3033 | Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb |
| abs810355 | FH535 |
| abs810648 | XAV-939 |
| 29051021 | HISTRAP HP 1 X 1 ML |
| 17531806 | NI SEPHAROSE 6 FF 5 ML |
| 17528101 | GSTRAP HP 5 X 1 ML |
| 17075601 | GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B 10 ML |
| 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
| BR100530 | Series S Sensor Chip CM5 |
| abs50034 | CHIP試劑盒 |
| abs9649 | Co-IP試劑盒 |
- 預(yù)染蛋白Marker的功能、分類、使用及應(yīng)用
- A-769662作為AMPK激活劑在炎癥、動物肥胖和腫瘤模型中的研究應(yīng)用
- SBI-0206965作為ULK1/2與AMPK雙重抑制劑在腫瘤研究中的應(yīng)用
- Everolimus (RAD001)作為mTOR抑制劑在炎癥、免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用
- 核受體共激活因子RAP250作為BAT代謝負(fù)調(diào)控因子的作用機(jī)制研究
- AZD8055作為mTOR抑制劑的機(jī)制及在腫瘤細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中的研究應(yīng)用
- Nutlin-3a(Rebemadlin)作為MDM2拮抗劑在動物模型中的研究應(yīng)用
- TIANGEN質(zhì)粒大提解決方案的介紹及數(shù)據(jù)展示
Copyright(C) 1998-2026 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com