蛋白質(zhì)表達(dá)與純化的關(guān)鍵步驟及常見(jiàn)問(wèn)題解答

蛋白質(zhì)，作為生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者，構(gòu)成了生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。中心法則的提出讓分子—蛋白研究得以具象化，DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，使神奇而復(fù)雜的生命現(xiàn)象得以解析。

從序列的合成至其轉(zhuǎn)化鑒定，再到蛋白質(zhì)的表達(dá)以及最終的純化，每一個(gè)環(huán)節(jié)都需要精確且細(xì)致的設(shè)計(jì)而這一全過(guò)程的探索，無(wú)疑為我們打開(kāi)了生命研究的新視野。在此過(guò)程中，MCE 提供全品類(lèi)的產(chǎn)品和全方位的服務(wù)助力您的科學(xué)研究。

1 載體構(gòu)建及檢測(cè)

載體構(gòu)建是生物技術(shù)中的一項(xiàng)關(guān)鍵步驟，主要用于克隆、表達(dá)特定基因以及進(jìn)行基因編輯等研究。MCE 提供分子克隆工具、瓊脂糖凝膠電泳等產(chǎn)品，使您的載體構(gòu)建和分析檢測(cè)過(guò)程更加快捷高效。

 
2 蛋白樣本制備

蛋白樣本制備是蛋白生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心步驟。其主要目的是：從組織或細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，用于蛋白質(zhì)純化和濃縮，進(jìn)而檢測(cè)和分析。MCE 提供的抑制劑 Cocktail 和裂解液能在最大程度上確保蛋白的有效提取，為您的實(shí)驗(yàn)研究提供有力保障。

 
3 蛋白純化

蛋白純化的目的是從復(fù)雜的樣本(如細(xì)胞裂解液或組織提取物)中篩選、提取出特定的蛋白質(zhì)。在分子克隆載體構(gòu)建設(shè)計(jì)時(shí)，通過(guò)添加易于檢測(cè)的標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)后續(xù)蛋白質(zhì)的純化。MCE 提供磁珠、瓊脂糖磁珠、瓊脂糖等純化介質(zhì)，能夠有效地純化帶有 HA、c-Myc、His、GST、Flag 等標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，同時(shí) MCE 也提供抗體純化相關(guān)產(chǎn)品。

 
4 蛋白檢測(cè)分析

蛋白質(zhì)分析檢測(cè)在生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中扮演著重要的角色。MCE 可提供一套全面的產(chǎn)品工具，以助力您高效進(jìn)行蛋白質(zhì)的純度、大小和濃度等檢測(cè)。

 
客戶(hù)驗(yàn)證：

穩(wěn)定可靠，重復(fù)性高

特異性強(qiáng)，背景干凈

 
5 常見(jiàn)問(wèn)題解答

1. HY-K1004 與 HY-K1007 兩款核酸染料的區(qū)別是什么？

 
2. PCR 擴(kuò)增效率低，條帶較弱或無(wú)擴(kuò)增，該如何解決？

(1) 酶：實(shí)驗(yàn)表明，PCR 酶對(duì)于 DNA 具有一定的偏好性。如使用一種酶經(jīng)過(guò)優(yōu)化難以獲得理想擴(kuò)增時(shí)，可以嘗試其它 PCR 酶。

(2) 模板引物：確保模板、引物的品質(zhì)，保證沒(méi)有降解。另外，如果模板含有較多的抑制物時(shí)(如植物基因組模板)，推薦使用抗抑制能力強(qiáng)的 PCR 酶；還可以對(duì)模板進(jìn)行梯度稀釋后擴(kuò)增，摸索合適的模板用量。

(3) 反應(yīng)體系與條件：增加循環(huán)數(shù)、降低退火溫濕度、適當(dāng)提高 Mg2+工作濃度，都可以提高擴(kuò)增效率，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致特異性與保真性下降，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求優(yōu)化合適的條件。

3. 現(xiàn)有幾款裂解液之間有什么區(qū)別？該如何選擇？

 
4. 抑制劑該如何選擇？

注：HY-K0021 和 HY-K0023 均為 HY-K0022 的有效補(bǔ)充，使用時(shí)建議選擇組合形式：HY-K0021 + HY-K0022 或 HY-K0022 + HY-K0023 ，可以單獨(dú)使用，但不推薦。

5. His 標(biāo)簽蛋白純化后蛋白純度不佳，是什么原因?qū)е碌�？有哪些方法可以改善�?br />
(1) 洗脫條件：使用咪唑濃度梯度或 pH 值梯度洗脫。不同蛋白質(zhì)最佳洗脫條件不同，需要摸索優(yōu)化；

(2) 介質(zhì)因素：雜蛋白與介質(zhì)可能存在非特異性結(jié)合，可以在在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入一定濃度的咪唑 ( 推薦濃度 : ≤ 20 mM，因蛋白而異 )，降低非特異性結(jié)合；

(3) 蛋白間作用：雜蛋白與目的蛋白可能存在非特異性結(jié)合，可以在在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入非離子型去垢劑( Triton X-100: ≤ 1% )、甘油 ( ≤ 10% )、NaCl ( ≥ 300 mM )、還原劑 ( β- 巰基乙醇 : ≤ 20 mM ) 等組分；

(4) 目的蛋白降解：建議在低溫下純化目的蛋白，并在平衡緩沖液與樣品緩沖液中加入蛋白酶抑制劑( 如 HY-K0010、HY-K0011 等 )；

(5) 存在表達(dá)提前終止：表達(dá)終止導(dǎo)致蛋白未正確攜帶標(biāo)簽，建議更換表達(dá)載體。

6. 磁珠與瓊脂糖凝膠產(chǎn)品應(yīng)該如何選擇？

(1) 免疫沉淀( 當(dāng)樣品體積 < 2 mL )。在日常小型分離特定蛋白質(zhì)和蛋白復(fù)合物時(shí)，磁珠可實(shí)現(xiàn)結(jié)合能力/得率、可重復(fù)性純度和成本節(jié)約之間的平衡。當(dāng)進(jìn)行手動(dòng)和自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn) IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP 和 pull-down 反應(yīng)并立即用于后續(xù)檢測(cè)分析時(shí)，磁珠是最佳選擇。

(2) 蛋白質(zhì)純化(當(dāng)樣品體積 > 2 mL)。當(dāng)需要獲得大量目標(biāo)蛋白時(shí)，可選用瓊脂糖凝膠，瓊脂糖適用于柱親和色譜或獨(dú)立大型旋轉(zhuǎn)杯免疫沉淀反應(yīng)。

7. 為什么蛋白質(zhì)印跡條帶大小與預(yù)期的不同？

蛋白質(zhì)印跡是一種基于蛋白質(zhì)大小來(lái)分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。一般來(lái)講，蛋白質(zhì)越小，在膠上的遷移速度越快。但遷移速度也受其它因素的影響，因此，觀察到的實(shí)際條帶大小可能與預(yù)測(cè)的不同。

常見(jiàn)的因素：
(1) 翻譯后修飾：磷酸化、糖基化等，蛋白實(shí)際會(huì)偏大
(2) 翻譯后切割：許多蛋白先被合成為前蛋白，然后被切割產(chǎn)生活性形式，例如前半胱天冬酶，蛋白實(shí)際會(huì)偏�。�
(3) 剪接變體和異形體：可變剪接和異形體可能從同一基因產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)；
(4) 聚體：蛋白質(zhì)形成多聚體。這種情況通常在還原條件下可以緩解，但強(qiáng)相互作用會(huì)導(dǎo)致較大的條帶出現(xiàn)。


6 Publications Citing Use of MCE Products

[1] Cell. 2024 Feb 15;187(4):882-896.e17.
[2] Cell. 2024 Apr 25;187(9):2288-2304.e27.
[3] Nature. 2023 Apr;616(7956):357-364.
[4] Nature. 2023 Mar;615(7952):526-534.
[5] Nature. 2023 Mar;615(7951):349-357.
[6] Cancer Cell. 2024 May 13;42(5):869-884.e9.
[7] Cancer Cell. 2024 Jun 10;42(6):968-984.e9.
[8] Cell Res. 2024 Feb;34(2):140-150.
[9] Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 8;9(1):63.
[10] Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 4;9(1):58.
[11] Immunity. 2024 Jun 11;57(6):1289-1305.e9.
[12] Immunity. 2024 Mar 12;57(3):495-512.e11.
[13] Nat Genet. 2024 Apr;56(4):637-651.
[14] Cell Host Microbe. 2024 Feb 14;32(2):191-208.e9.
[15] Mol Plant. 2024 Apr 1;17(4):598-613.

MCE 中國(guó)
免費(fèi)服務(wù)熱線: 400-820-3792
客服中心: 021-38924433 / 021-58955995
技術(shù)服務(wù)與支持:
021-38924429/021-58950656/ tech@MedChemExpress.cn
公司地址: 上海市浦東新區(qū)張衡路 1999 弄 3 號(hào)樓
郵箱:sales@MedChemExpress.cn
官網(wǎng)：www.MedChemExpress.cn

MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
For research use only. We do not sell to patients.