2026《歐洲藥典》更新支原體檢測(cè)章節(jié)中“上清+細(xì)胞”的取樣要求介紹

• 核心變化：從“固定程序”轉(zhuǎn)向基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（Risk Assessment）的方法選擇，強(qiáng)調(diào)科學(xué)決策。
• 技術(shù)升級(jí)： 核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）地位提升，成為與培養(yǎng)法并列的核心方法，并建立了詳細(xì)的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。
• 操作規(guī)范： 明確了“上清+細(xì)胞”的聯(lián)合取樣要求，以確保檢測(cè)的全面性。
• 質(zhì)量控制： 新增了針對(duì)NAT和指示細(xì)胞法的抑制物測(cè)試要求，強(qiáng)化了檢測(cè)結(jié)果的有效性。

• 支原體屬（Mycoplasma）
• 支原體形屬（Mycoplasmoides）
• 中支原體屬（Mesomycoplasma）
• 后支原體屬（Metamycoplasma）
• 支原體蟲(chóng)屬（Mycoplasmosis）
• 脲原體屬（Ureaplasma）
• 無(wú)膽甾原體屬（Acholeplasma）
• 螺原體屬（Spiroplasma）

而舊版僅籠統(tǒng)稱為“mycoplasmas”。

（2）引入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估原則
新版重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)方法選擇應(yīng)基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（risk assessment），需考慮培養(yǎng)基、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品類型、潛在污染物種類等因素。這是一個(gè)根本性的理念轉(zhuǎn)變，從固定的程序轉(zhuǎn)向基于科學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)管理。

（3）明確取樣要求
新版新增并強(qiáng)調(diào)：由于支原體可能附著或存在于細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)時(shí)應(yīng)同時(shí)取樣細(xì)胞和上清液（whenever possible）。

（4）增加抑制物測(cè)試
除了在培養(yǎng)法延續(xù)保留抑制物測(cè)試，在指示細(xì)胞法和核酸法都新增了抑制物測(cè)試，并提出了具體方案和測(cè)試內(nèi)容。

02 關(guān)于核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）
（1）地位明確
在新版開(kāi)篇即介紹了“本章描述了三種支原體檢測(cè)方法：培養(yǎng)法、指示細(xì)胞培養(yǎng)法和核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）”，再次明確了“在經(jīng)過(guò)適當(dāng)驗(yàn)證后，NAT可作為上述一種或兩種方法的替代方法。”

（2）分類細(xì)化
新版將NAT細(xì)分為三種應(yīng)用模式：

• 直接NAT（Direct NAT）
• 基于細(xì)胞的富集后NAT（Cell-based enrichment followed by NAT）
• 基于培養(yǎng)基的富集后NAT（Media-based enrichment followed by NAT）

（3）驗(yàn)證要求具體化
新版為NAT提供了極其詳細(xì)的驗(yàn)證指南，包括：

• 明確的可比性標(biāo)準(zhǔn)：作為培養(yǎng)法替代方法需達(dá)到≤10 CFU/mL的靈敏度；作為指示細(xì)胞法替代方法需達(dá)到≤100 CFU/mL的靈敏度。
• 參考標(biāo)準(zhǔn)品：引入了WHO支原體DNA國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（WHO IS for mycoplasma DNA）作為校準(zhǔn)工具。
• 菌株表征：對(duì)用于驗(yàn)證用的菌株制備和表征提出了明確要求。其中，對(duì)活菌參考品同時(shí)進(jìn)行CFU（菌落形成單位）和GC（基因組拷貝數(shù)）的測(cè)定，并定義了GC/CFU比率（應(yīng)<10）的接受標(biāo)準(zhǔn)，使NAT結(jié)果更具可比性和可靠性。
• 檢測(cè)限：應(yīng)使用一組已表征和校準(zhǔn)的菌株進(jìn)行一系列的稀釋。如果僅使用DNA標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)加以論證。
• 抑制性物質(zhì)測(cè)試：為NAT專門提出了抑制性物質(zhì)測(cè)試要求，并在驗(yàn)證指南中示例了測(cè)試方案。

03 培養(yǎng)法與指示細(xì)胞法的優(yōu)化
（1）明確培養(yǎng)條件適用性
培養(yǎng)法與指示細(xì)胞培養(yǎng)法僅適用于最適生長(zhǎng)溫度35–38℃的菌種；未提及的產(chǎn)品相關(guān)菌種或檢測(cè)昆蟲(chóng)、魚(yú)類、植物細(xì)胞系等其他細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)可能需另設(shè)條件。

（2）抑制性物質(zhì)測(cè)試
新版培養(yǎng)法里繼續(xù)沿用舊版的抑制性物質(zhì)測(cè)試內(nèi)容，在指示細(xì)胞法新增抑制性物質(zhì)測(cè)試，強(qiáng)調(diào)了抑制性物質(zhì)測(cè)試是針對(duì)特定產(chǎn)品的，且在工藝變更后需重新進(jìn)行。新版EP2.6.7培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法在遇到抑制性物質(zhì)時(shí)的處理策略有不同側(cè)重點(diǎn)：

i. 培養(yǎng)法中的抑制性物質(zhì)處理方式
主要策略：稀釋 (Dilution)

• 原理：通過(guò)降低待檢產(chǎn)品在培養(yǎng)基中的最終濃度，來(lái)減弱或消除其抑制效應(yīng)。
• 驗(yàn)證：必須通過(guò)重復(fù)抑制性物質(zhì)測(cè)試來(lái)證明所采用的稀釋方案能有效中和抑制作用。

• 同樣適用！新版EP明確指出：“若進(jìn)行樣品稀釋，可使用更大體積的培養(yǎng)基或?qū)⒔臃N物體積分配到多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器中。”
• 這與培養(yǎng)法的思路一致，通過(guò)降低產(chǎn)品濃度來(lái)減輕對(duì)細(xì)胞的毒性或?qū)χг�體附著的干擾。

• 特指針對(duì)病毒產(chǎn)品的場(chǎng)景。
• 原理：如果待檢產(chǎn)品是具有細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的病毒懸液，病毒本身會(huì)殺死指示細(xì)胞，導(dǎo)致無(wú)法觀察。此時(shí)，可以使用對(duì)該病毒有特異性、但對(duì)支原體無(wú)抑制作用的抗血清來(lái)中和病毒的感染性，從而保護(hù)指示細(xì)胞。
• 關(guān)鍵點(diǎn)：“中和”在這里是一個(gè)非常具體的操作，專指用抗血清對(duì)抗病毒，而不是泛指所有抑制性物質(zhì)的處理。

• 新版EP提到，在某些復(fù)雜情況下，可以采用“檢測(cè)對(duì)照細(xì)胞”等替代方法，但這些方法必須經(jīng)過(guò)充分論證并獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。

04 理念與措辭的與時(shí)俱進(jìn)
（1）聯(lián)合使用原則的靈活性
舊版規(guī)定“必須”（are used）聯(lián)合使用兩種方法。新版改為“應(yīng)聯(lián)合使用（should be used conjointly）”，但增加了重要的例外條款：“除非各論另有規(guī)定，或經(jīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估證明并獲得主管當(dāng)局授權(quán)”，確保“可培養(yǎng)”和“不可培養(yǎng)”支原體的檢出。這體現(xiàn)了監(jiān)管的靈活性和基于科學(xué)決策的原則。

（2）強(qiáng)調(diào)“有效性”（validity）
新版在結(jié)果解釋部分更清晰地定義了試驗(yàn)無(wú)效的各種情況，強(qiáng)化了質(zhì)量控制的概念。

新版EP 2.6.7相較于舊版，其核心變化在于：

1. 從固定程序到基于風(fēng)險(xiǎn)：引入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估作為方法選擇的基礎(chǔ)。
2. 全面擁抱NAT技術(shù)：將NAT的地位提升至核心方法，并為其建立了全面、嚴(yán)謹(jǐn)、可量化的驗(yàn)證和應(yīng)用框架。
3. 內(nèi)容更全面、精確：更精確地明確了支原體檢測(cè)范圍（如螺原體），細(xì)化了操作要求、明確了取樣策略。
4. 語(yǔ)言和結(jié)構(gòu)更現(xiàn)代化：文本結(jié)構(gòu)清晰，邏輯嚴(yán)謹(jǐn)，術(shù)語(yǔ)準(zhǔn)確，更符合當(dāng)前GMP和監(jiān)管科學(xué)的要求。

這些修改反映了近幾年生物制藥行業(yè)，特別是在細(xì)胞庫(kù)、病毒載體和先進(jìn)治療產(chǎn)品（ATMPs）等領(lǐng)域的發(fā)展，以及對(duì)快速、靈敏、可靠的支原體檢測(cè)方法的迫切需求。

相比于其他國(guó)家藥典，EP 2.6.7較早收錄了NAT方法。到目前為止，我國(guó)藥典還沒(méi)有支原體NAT法章節(jié)。在實(shí)際檢測(cè)實(shí)踐中，我們常參照EP 2.6.7。新版EP 2.6.7的修改對(duì)我們實(shí)際的支原體檢測(cè)實(shí)踐具有重要的參考和指導(dǎo)意義。

湖州申科開(kāi)發(fā)了系列支原體DNA提取、檢測(cè)試劑盒及驗(yàn)證菌株，符合新版《歐洲藥典》支原體檢測(cè)要求，助力產(chǎn)品合規(guī)放行。