多光子顯微鏡（MPM）生物組織成像技術(shù)新進(jìn)展

多光子顯微鏡（MPM）是一種強(qiáng)大的無(wú)標(biāo)記生物組織成像技術(shù)，能夠通過(guò)非線(xiàn)性光學(xué)效應(yīng)獲取多種對(duì)比度信息。本文介紹了一項(xiàng)創(chuàng)新研究，開(kāi)發(fā)了一種緊湊型多模態(tài)成像系統(tǒng)，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)雙光子顯微鏡（2PM）和三光子顯微鏡（3PM）的圖像采集。該系統(tǒng)采用雙激發(fā)波長(zhǎng)（790 nm和1580 nm），在無(wú)需標(biāo)記的情況下，同步獲取雙光子激發(fā)熒光（2PEF）、二次諧波生成（SHG）和三次諧波生成（THG）信號(hào)，從而提供細(xì)胞、膠原纖維和界面等結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)信息。研究重點(diǎn)解決了雙波長(zhǎng)同時(shí)激發(fā)時(shí)的信號(hào)分離挑戰(zhàn)，并提出了基于核的非線(xiàn)性縮放（KNS）去噪算法，以提升低信噪比圖像的質(zhì)量。通過(guò)生物樣品實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了同時(shí)成像在減少運(yùn)動(dòng)偽影和熱損傷方面的優(yōu)勢(shì)，為無(wú)標(biāo)記在體成像奠定了基礎(chǔ)。

本研究的核心貢獻(xiàn)由WENTAO WU、CHRISTOPH BRANDT、XIN ZHOU和SHUO TANG團(tuán)隊(duì)完成，研究成果以題為“Label-free multimodal imaging with simultaneous two-photon and three-photon microscopy and kernel-based nonlinear scaling denoising”的論文形式，發(fā)表在光學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊《Biomedical Optics Express》上。

重要發(fā)現(xiàn)
01系統(tǒng)設(shè)計(jì)與同時(shí)成像原理
研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一套基于光纖的緊湊型多模態(tài)MPM系統(tǒng)，其核心創(chuàng)新在于通過(guò)單一激光源（摻鉺光纖激光器）產(chǎn)生雙波長(zhǎng)激發(fā)光。激光經(jīng)周期性極化鎂氧化物摻雜鈮酸鋰（PPLN）晶體倍頻后，輸出790 nm和1580 nm的飛秒脈沖，分別用于激發(fā)2PM和3PM信號(hào)。系統(tǒng)采用微型微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS）鏡進(jìn)行XY掃描，并結(jié)合形狀記憶合金驅(qū)動(dòng)器實(shí)現(xiàn)軸向深度掃描，整體結(jié)構(gòu)小巧，潛在支持手持式成像頭開(kāi)發(fā)。光學(xué)布局中，通過(guò)二向色分光鏡精確分離2PEF、SHG和THG信號(hào)，但由于2PEF和THG光譜部分重疊，檢測(cè)通道存在串?dāng)_，需通過(guò)后處理減法算法消除。

同時(shí)成像的優(yōu)勢(shì)顯著體現(xiàn)在速度提升和偽影抑制上。與順序采集（先2PM后3PM）相比，同步采集將成像時(shí)間減半，避免了樣本運(yùn)動(dòng)或機(jī)械漂移導(dǎo)致的空間錯(cuò)位。實(shí)驗(yàn)以小鼠股骨為例，順序采集時(shí)SHG和THG圖像因5分鐘延遲出現(xiàn)約6μm偏移，而同步采集基本消除該問(wèn)題。此外，系統(tǒng)利用雙波長(zhǎng)的焦距偏移（約80μm）分散激光能量，熱模擬顯示雙焦點(diǎn)成像比單焦點(diǎn)最高溫度降低約50%，減少了組織熱損傷風(fēng)險(xiǎn)。

KNS的普適性通過(guò)多種生物樣本驗(yàn)證，例如小鼠耳廓軟骨層的THG圖像（顯示軟骨細(xì)胞陷窩的蜂窩結(jié)構(gòu)）和紅楓葉片的SHG圖像（源于葉綠體中淀粉和細(xì)胞壁纖維素）。在模擬測(cè)試中，以高信噪比圖像為基準(zhǔn)，添加高斯噪聲后，KNS處理的結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（SSIM）和峰值信噪比（PSNR）均優(yōu)于N2V，且避免了深度學(xué)習(xí)黑箱問(wèn)題的不確定性

多模態(tài)圖像的合并進(jìn)一步體現(xiàn)了KNS的去噪貢獻(xiàn)。未去噪時(shí)，低信噪比THG通道的噪聲會(huì)掩蓋其他通道細(xì)節(jié)；經(jīng)KNS處理后，噪聲顯著抑制，組織特征（如骨細(xì)胞小管）清晰可辨，提升了圖像可讀性和分析精度。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
本研究的首要突破是解決了多模態(tài)成像中長(zhǎng)期存在的技術(shù)難題。傳統(tǒng)順序采集2PM和3PM圖像時(shí)，時(shí)間延遲易引入運(yùn)動(dòng)偽影和機(jī)械漂移，而同時(shí)成像通過(guò)雙波長(zhǎng)同步激發(fā)消除了這一瓶頸。系統(tǒng)設(shè)計(jì)上，利用單一激光源頻分雙光束，避免了多激光對(duì)齊的復(fù)雜性，結(jié)合微型掃描元件，實(shí)現(xiàn)了緊湊便攜的架構(gòu)，為在體臨床應(yīng)用鋪平道路。此外，針對(duì)低信號(hào)通道的噪聲問(wèn)題，KNS算法以簡(jiǎn)單數(shù)學(xué)縮放替代復(fù)雜機(jī)器學(xué)習(xí)，在超低信噪比條件下仍能保留組織特征，解決了多模態(tài)圖像合并時(shí)的質(zhì)量失衡問(wèn)題。

在新技術(shù)應(yīng)用方面，KNS去噪方法的提出是一大亮點(diǎn)。其基于局部核比較的機(jī)制，無(wú)需訓(xùn)練數(shù)據(jù)或 ground truth，克服了傳統(tǒng)濾波器的細(xì)節(jié)丟失缺陷，也規(guī)避了深度學(xué)習(xí)對(duì)大量數(shù)據(jù)的依賴(lài)。算法的高效性使其有望集成于實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)，滿(mǎn)足臨床快速診斷需求。同時(shí)，焦距偏移的“副作用”被轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢(shì)，通過(guò)分散激光能量降低熱損傷，體現(xiàn)了設(shè)計(jì)巧思。

總結(jié)與展望
本文報(bào)道的緊湊型多模態(tài)MPM系統(tǒng)，通過(guò)同時(shí)2PM和3PM成像與KNS去噪技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了高速、高質(zhì)、無(wú)標(biāo)記的生物組織可視化。系統(tǒng)克服了雙波長(zhǎng)激發(fā)的信號(hào)分離挑
并利用焦距偏移降低熱風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)合創(chuàng)新去噪算法，顯著提升了多模態(tài)圖像的實(shí)用性和可靠性。實(shí)驗(yàn)證明，該技術(shù)在動(dòng)物和植物樣本中均能提供互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)信息，為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究提供了強(qiáng)大工具。

DOI:10.1364/BOE.504550.