突破：一種使小鼠腦皮層100-400微米深度熒光增強的生物傳感器
在哺乳動物體內，L-乳酸日益被視為一種重要的細胞間能量載體，但其在細胞外環(huán)境中釋放與攝取的空間和時間動態(tài)變化仍存在諸多未解之謎。傳統(tǒng)監(jiān)測方法如酶電極技術，雖能用于活體測量，但存在空間分辨率低、對組織具有侵入性等局限。為了以更高的時空分辨率在活體中原位、實時觀測細胞外L-乳酸的動態(tài)變化，研究人員開發(fā)了一種名為R-eLACCO2.1的紅色熒光基因編碼生物傳感器。該傳感器基于乳酸結合蛋白TTHA0766與紅色熒光蛋白cpmApple構建，通過定向進化與優(yōu)化，實現(xiàn)了在培養(yǎng)細胞、小鼠腦切片以及活體小鼠中對細胞外L-乳酸的高靈敏度、高特異性成像。R-eLACCO2.1不僅可用于熒光強度成像，還可作為熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）傳感器，并能與綠色熒光鈣離子指示劑（如GCaMP）進行雙色成像，從而同步監(jiān)測神經活動與代謝變化。
本研究的核心貢獻者包括Yuki Kamijo, Philipp Machler, Natalie Ness, Cong Quang Vu, Tsukasa Kusakizako, Jamsad Mannuthodikayil, Zaneta Ku, Marc Boisvert, Ekaterina Grebenik, Ikumi Miyazaki, Rina Hashizume, Haruaki Sato, Rui Liu, Yukiko Hori, Taisuke Tomita, Tetsuro Katayama, Akihiro Furube, Gabriela Caraveo, Marie-Eve Paquet, Mikhail Drobizhev, Osamu Nureki, Satoshi Arai, Marco Brancaccio, Robert E. Campbell, David Kleinfeld & Yusuke Nasu。他們的研究成果以論文“A red fluorescent genetically encoded biosensor for in vivo imaging of extracellular L-lactate dynamics”的形式，于2025年10月發(fā)表在學術期刊《Nature Communications》上。
重要發(fā)現(xiàn)
01核心貢獻：新一代紅色熒光乳酸傳感器的誕生
本研究最核心的貢獻是成功開發(fā)了R-eLACCO2.1，這是首個高性能的紅色熒光細胞外L-乳酸基因編碼生物傳感器。其開發(fā)過程始于將綠色乳酸傳感器eLACCO1中的綠色熒光蛋白（cpGFP）替換為紅色熒光蛋白（cpmApple），構建出初始原型R-eLACCO0.1。隨后，研究團隊通過多輪定向進化（包括隨機突變和定點誘變），大幅提升了傳感器的熒光響應度（ΔF/F），最終獲得了高度優(yōu)化的變體R-eLACCO2。通過引入Leu79Ile突變以調節(jié)其對乳酸的親和力，得到了最終的工作版本R-eLACCO2.1，其表觀Kd為5.1 mM，非常適合感知生理范圍內的細胞外乳酸濃度變化。同時，研究人員還構建了無響應突變體R-deLACCOctrl作為對照。
在光學特性上，R-eLACCO2.1展現(xiàn)出卓越的性能。在結合L-乳酸后，其最大激發(fā)峰從578 nm藍移至566 nm，最大發(fā)射峰從602 nm藍移至594 nm，這種激發(fā)光譜的位移是其在比率式或強度測量中產生高對比度響應的基礎。其熒光壽命也會隨乳酸濃度增加而顯著變化（Δτ ≈ 0.37 ns），這使其成為一種有效的FLIM生物傳感器。FLIM技術的優(yōu)勢在于其信號不受傳感器表達濃度、激發(fā)光功率和焦點漂移的影響，非常適合在復雜的活體環(huán)境中進行定量成像。此外，R-eLACCO2.1在雙光子激發(fā)下也表現(xiàn)出良好的特性，使其能夠用于深層組織成像。研究人員還通過冷凍電鏡技術解析了R-eLACCO2在乳酸結合狀態(tài)下的高分辨率結構（2.7 Å），揭示了其分子內部關鍵氨基酸殘基（如Lys211）在乳酸結合后通過調控發(fā)色團微環(huán)境來改變熒光性質的機制。
03細胞表面定位的精準優(yōu)化
對于細胞外靶向的傳感器而言，能否高效且特異地定位到細胞膜表面至關重要。研究團隊對此進行了系統(tǒng)性優(yōu)化。他們篩選了多種C-末端錨定域（包括基于蛋白質的跨膜域和基于糖基磷脂酰肌醇GPI的錨）以及N-末端信號肽序列。結果表明，GPI錨定系統(tǒng)（如COBRA, CD59, GFRA1）能實現(xiàn)高效的細胞表面定位，而蛋白質跨膜錨定效果不佳。在信號肽篩選中，大多數(shù)序列也能引導傳感器到達膜上，其中IgK、HA和pat-3序列能帶來最亮的熒光信號。最終，結合熒光響應度（ΔF/F）測試，確定IgK信號肽與COBRA GPI錨的組合為R-eLACCO2.1的最佳配置，使其在HeLa細胞中ΔF/F高達6.5，遠超早期版本。
04在活體成像中的突破性應用
研究的最終目的是在活體動物中驗證傳感器的功能。研究人員通過向小鼠初級觸覺體感皮層（vS1）注射腺相關病毒（AAV），使神經元特異性表達R-eLACCO2.1。靜脈注射L-乳酸后，利用雙光子激光掃描顯微鏡結合自適應光學（AO2P）技術，在清醒小鼠大腦皮層100微米和400微米深度均觀察到了R-eLACCO2.1強烈的熒光強度增加，且其信號變化與植入同一腦區(qū)的電化學乳酸探針的記錄結果高度相關，證實了其在活體內的可靠性。更重要的是，R-eLACCO2.1的性能優(yōu)于此前報道的綠色傳感器eLACCO2.1，在活體中具有更高的靈敏度。
更引人入勝的是對內源性乳酸動態(tài)的觀測。在清醒小鼠中，吹動胡須刺激或小鼠自發(fā)運動后，V1S區(qū)層II/III神經元的細胞外L-乳酸水平均呈現(xiàn)顯著上升。而通過雙色成像技術，研究人員實現(xiàn)了對同一批神經元同時記錄R-eLACCO2.1（報告細胞外乳酸）和GCaMP6f（報告細胞內鈣離子，即神經活動）。令人驚訝的是，在無明顯運動事件的自發(fā)神經活動期間，他們觀察到神經激活（GCaMP6f信號升高）之后，細胞外乳酸濃度會出現(xiàn)一個短暫的下降，隨后才恢復至基線水平。這一發(fā)現(xiàn)暗示了神經活動可能伴隨著局部乳酸的快速消耗，為了解大腦代謝與神經活動之間的復雜互動提供了全新的視角。
創(chuàng)新與亮點
R-eLACCO2.1的誕生，在光學成像與生物傳感領域取得了多項重要突破。它成功突破了光譜限制，實現(xiàn)了活體代謝物的多參數(shù)同步成像。作為首個紅色熒光細胞外乳酸傳感器，它完美地解決了綠色熒光傳感器（如eLACCO系列）與同樣為綠色的神經活動指示劑（如GCaMP）在同時使用時難以區(qū)分信號的難題。這種“光譜正交性”使得研究人員能夠在不相互干擾的情況下，同時對神經電活動（通過GCaMP）和能量代謝（通過R-eLACCO2.1）進行觀測，為解析大腦功能提供了前所未有的多維信息。
該傳感器集成了熒光強度與熒光壽命兩種成像模式，極大地增強了其應用的靈活性和可靠性。FLIM模式特別適合于活體定量研究，因為它能有效克服因傳感器表達量差異、組織光散射和吸收所導致的信號波動，提供更穩(wěn)定、更精確的乳酸濃度讀數(shù)。這種雙模式兼容性使R-eLACCO2.1能夠適應從細胞水平的高通量篩選到活體動物深層組織成像的多種實驗場景。
首次在清醒哺乳動物中，以細胞級分辨率實時觀測到了行為刺激和自發(fā)神經活動所引發(fā)的內源性細胞外乳酸動態(tài)變化。特別是發(fā)現(xiàn)了神經活動后乳酸可能被快速消耗的瞬時下降現(xiàn)象，這挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的“神經活動必然伴隨乳酸產出增加”的簡單認知，為重新審視和驗證諸如“星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭（ANLS）”等經典假說提供了強大的新工具。總結與展望
本研究成功開發(fā)了高性能紅色熒光基因編碼生物傳感器R-eLACCO2.1，實現(xiàn)了在培養(yǎng)細胞、腦切片及活體小鼠中對細胞外L-乳酸動態(tài)的高時空分辨率、高特異性成像。其紅色熒光特性、優(yōu)異的靈敏度以及對熒光壽命成像的兼容性，使其成為研究大腦能量代謝與神經活動之間復雜關系的理想工具。利用R-eLACCO2.1，研究團隊在清醒小鼠中揭示了運動和行為刺激引起的乳酸動態(tài)變化，并首次通過雙色成像觀察到神經活動后細胞外乳酸的瞬時消耗，為理解乳酸在大腦中的實時功能提供了全新視角。展望未來，R-eLACCO2.1作為一種強大的成像工具，將極大地推動神經科學、代謝生理學等領域的發(fā)展，特別是在探究阿爾茨海默病、肌萎縮側索硬化癥等與乳酸代謝紊亂相關的神經系統(tǒng)疾病的機制方面具有廣闊的應用前景。它將繼續(xù)幫助科學家們描繪乳酸在哺乳動物生理與病理過程中所扮演的復雜而關鍵的角色。
聲明：本文僅用作學術目的。
Kamijo Y, Mächler P, Ness N, Vu CQ, Kusakizako T, Mannuthodikayil J, Ku Z, Boisvert M, Grebenik E, Miyazaki I, Hashizume R, Sato H, Liu R, Hori Y, Tomita T, Katayama T, Furube A, Caraveo G, Paquet ME, Drobizhev M, Nureki O, Arai S, Brancaccio M, Campbell RE, Kleinfeld D, Nasu Y. A red fluorescent genetically encoded biosensor for in vivo imaging of extracellular L-lactate dynamics. Nat Commun. 2025 Oct 29;16(1):9531.
DOI:10.1038/s41467-025-64484-x.
