雙光子顯微鏡的MD-FSS技術用于清醒小鼠腦600微米深層亞細胞成像
在神經(jīng)科學研究領域，實現(xiàn)清醒活動小鼠大腦的高分辨率成像一直是一項重大挑戰(zhàn)。組織光學像差、散射以及動物運動偽影嚴重限制了成像質量。2025年10月，國際知名期刊《Nature Communications》在線發(fā)表了一項題為“Rapid adaptive optics enabling near noninvasive high-resolution brain imaging in awake behaving mice”的重要研究成果。該研究由Zhentao She、Yiming Fu、Yingzhu He、Gewei Yan、Wanjie Wu、Zhongya Qin和Jianan Qu組成的團隊完成，開發(fā)了一種名為“多路復用數(shù)字焦點傳感與成形”（MD-FSS）的新型快速自適應光學系統(tǒng)。
本研究提出了一種結合雙光子顯微鏡（2PM）的MD-FSS技術，能夠在約0.1秒內(nèi)完成單次像差點擴散函數(shù)（PSF）的精確測量，有效校正深層組織中的像差和散射，從而在清醒活動小鼠腦中實現(xiàn)亞細胞級分辨率成像。通過薄化顱骨窗和光學透明顱骨窗這兩種近乎無創(chuàng)的方式，研究人員成功對小鼠大腦皮層深度達600微米區(qū)域進行了高清成像，揭示了清醒與麻醉狀態(tài)下小膠質細胞功能狀態(tài)及微血管循環(huán)動力學的顯著差異，凸顯了在無創(chuàng)條件下研究清醒動物大腦功能的重要性。
重要發(fā)現(xiàn)
01核心技術原理：MD-FSS的工作機制
MD-FSS技術的核心創(chuàng)新在于通過多光束干涉實現(xiàn)快速焦點場傳感，并結合數(shù)字相位解調(diào)并行測量PSF的復振幅。該系統(tǒng)利用聲光偏轉器（AOD）生成多個具有不同空間和頻率偏移的弱掃描光束，使其與一束強靜態(tài)光束在焦平面上發(fā)生干涉。通過多通道數(shù)字快速傅里葉變換（FFT）檢測技術，系統(tǒng)能夠在不同調(diào)制頻率下解析出調(diào)制干涉信號的相位和振幅。
具體而言，每個弱掃描光束的PSF通過下行采樣方式進行測量，隨后通過校準相對振幅和相位偏移，將多個下行采樣的PSF合并重建為完整采樣的PSF。基于此重建的PSF，通過相位共軛和二維FFT計算生成校正波前，從而實現(xiàn)對像差和散射的精確補償。相比傳統(tǒng)的單光束傳感與成形（SD-FSS）方法，MD-FSS將PSF測量時間從數(shù)秒縮短至約0.1秒，速度提升高達八倍，且不犧牲信噪比或校正精度。
02實驗驗證與性能評估研究人員首先通過體外實驗驗證了MD-FSS的性能。他們使用成年小鼠提取的薄化顱骨作為散射介質，對固定熒光珠進行成像。實驗結果顯示，未經(jīng)自適應光學校正前，由于顱骨的高度混濁性，PSF嚴重畸變，呈現(xiàn)多個小旁瓣；而經(jīng)過MD-FSS校正后，信號強度增強了50倍，PSF恢復至接近衍射極限質量，旁瓣消失。
更重要的是，在清醒活動小鼠模型中，MD-FSS展現(xiàn)了其獨特優(yōu)勢。由于小鼠運動會導致成像視場內(nèi)頻繁快速的偏移，傳統(tǒng)SD-FSS方法因測量時間較長，其PSF測量會受到運動偽影的嚴重影響，導致校正波前無法有效提升信號強度，甚至引入額外像差降低成像質量。而MD-FSS憑借其快速測量能力，能夠在清醒小鼠中準確測量復雜像差PSF，顯著提升熒光強度和成像分辨率。
03生物成像應用：從結構到功能在成功驗證技術性能后，研究團隊將MD-FSS應用于多種生物成像場景，獲得了重要發(fā)現(xiàn)。小膠質細胞形態(tài)與動力學成像：在清醒活動的Cx3cr1-GFP轉基因小鼠中，通過薄化顱骨窗，研究人員實現(xiàn)了大腦皮層深處小膠質細胞的高分辨率結構成像。校正后，小膠質細胞的精細進程清晰可見，信號顯著增強。時間推移成像顯示，在麻醉狀態(tài)下，小膠質細胞變得更加分枝化，進程面積擴大；而在清醒狀態(tài)下，其形態(tài)動態(tài)截然不同。此外，通過脂多糖（LPS）誘導全局炎癥后，高分辨率成像清晰捕捉到小膠質細胞向血管遷移的動態(tài)過程。
神經(jīng)元鈣活動成像：在清醒小鼠的體感皮層和視覺皮層中，研究人員對表達GCaMP6s的神經(jīng)元進行了鈣成像。經(jīng)過MD-FSS校正后，神經(jīng)元胞體輪廓和側樹突清晰可辨，頂樹突細節(jié)得到極大恢復。在觸須刺激期間，鈣瞬變信號顯示出顯著改善的強度，并與刺激強烈同步。利用無慣性遠程聚焦模塊，團隊還實現(xiàn)了準同步多平面神經(jīng)元成像，揭示了觸須刺激期間頂樹突與胞體之間的同步活動。
微血管血流動力學與神經(jīng)血管耦合：研究還關注了微血管系統(tǒng)的精細結構成像。校正后，毛細血管結構清晰可辨，使得能夠通過線掃描成像測量清醒小鼠腦毛細血管中的紅細胞速度。統(tǒng)計分析表明，在同一毛細血管中，麻醉狀態(tài)下的紅細胞速度顯著增加。同時，通過神經(jīng)元活動和血管擴張的雙色成像，研究揭示了在刺激期間樹突神經(jīng)元活動與穿透性小動脈直徑之間的緊密耦合關系。在視覺刺激下，盡管神經(jīng)元反應表現(xiàn)出強烈的方向選擇性，但小動脈擴張并未顯示顯著的方向選擇性。
創(chuàng)新與亮點
01突破成像速度瓶頸
MD-FSS技術的核心突破在于解決了傳統(tǒng)自適應光學技術在清醒動物成像中的速度瓶頸問題。在清醒小鼠腦中，由于動物運動導致的引導星偏移會嚴重破壞波前校正所需的穩(wěn)定信號。MD-FSS通過多光束并行探測和數(shù)字FFT解調(diào)，將PSF測量時間從傳統(tǒng)方法所需的數(shù)秒縮短至約0.1秒，顯著降低了對運動偽影的敏感性，為實現(xiàn)清醒動物高分辨率成像提供了關鍵技術支撐。
MD-FSS采用創(chuàng)新的多光束干涉設計，通過AOD同時產(chǎn)生多個具有特定空間偏移和調(diào)制頻率的弱掃描光束。這一設計不僅加快了測量速度，還通過精確的相對振幅和相位校準，確保了完整PSF重建的準確性。研究人員還開發(fā)了簡化的雙棱鏡配置方法，有效補償了AOD引入的角色散，在保證性能的同時避免了復雜控制和功率損失。
03近乎無創(chuàng)的高分辨率成像能力
該研究展示了通過薄化顱骨窗和光學透明顱骨窗兩種近乎無創(chuàng)的方法，在清醒小鼠大腦中實現(xiàn)深度達600微米的亞細胞級分辨率成像。這一能力使得研究人員能夠在最小化組織損傷的情況下，研究大腦在生理狀態(tài)下的真實功能活動，為神經(jīng)科學研究提供了更為可靠的觀測窗口。
04多尺度生物功能成像驗證
MD-FSS技術不僅在校正性能上表現(xiàn)出色，更重要的是，其在多種生物成像場景中得到了充分驗證。從小膠質細胞形態(tài)動力學到神經(jīng)元鈣活動，從微血管循環(huán)到神經(jīng)血管耦合，研究團隊系統(tǒng)性地展示了該技術在解析大腦精細結構和功能方面的強大能力。這些實證研究不僅驗證了技術的可靠性，更提供了關于清醒與麻醉狀態(tài)下大腦功能差異的重要新見解。
總結與展望
本研究開發(fā)的MD-FSS技術成功解決了在清醒活動小鼠中進行高分辨率腦成像的關鍵技術難題，通過快速自適應光學校正實現(xiàn)了近乎無創(chuàng)的深層組織成像。該技術不僅顯著提升了成像速度和精度，更在多種生物應用場景中展現(xiàn)了其獨特價值，為研究大腦在生理狀態(tài)下的真實功能活動提供了強大工具。
展望未來，MD-FSS技術具有進一步優(yōu)化的巨大潛力。當前八光束設計已實現(xiàn)0.1秒的PSF測量，但通過增加光束數(shù)量和應用更先進的射頻驅動技術，測量速度有望進一步提升。隨著硬件性能的持續(xù)改進和算法的進一步優(yōu)化，該技術有望在更廣泛的生物醫(yī)學研究領域發(fā)揮重要作用，特別是在需要高時空分辨率的活體動態(tài)觀測場景中。
論文信息聲明：本文僅用作學術目的。
She Z, Fu Y, He Y, Yan G, Wu W, Qin Z, Qu J. Rapid adaptive optics enabling near noninvasive high-resolution brain imaging in awake behaving mice. Nat Commun. 2025 Oct 15;16(1):9167.
DOI:10.1038/s41467-025-64251-y.
