非侵入式活體多光子顯微技術(shù)應(yīng)用于同步測量多種血管動態(tài)變化

本研究的核心貢獻(xiàn)來自Naoki Honkura、Mark Richards、Barbara Lavina、Miguel Sainz-Jaspeado、Christer Betsholtz和Lena Claesson-Welsh等研究者。他們共同發(fā)表的論文題為“Intravital imaging-based analysis tools for vessel identification and assessment of concurrent dynamic vascular events”，發(fā)表在《Nature Communications》期刊。該研究通過高分辨率活體成像技術(shù)，揭示了血管在刺激下的動態(tài)響應(yīng)特性，為血管生物學(xué)提供了重要見解。

重要發(fā)現(xiàn)
01血管類型識別與分類 
血管系統(tǒng)包括小動脈、毛細(xì)血管和小靜脈等不同類型，它們對刺激的響應(yīng)存在顯著差異。傳統(tǒng)上，血管類型可通過直徑區(qū)分：小動脈和小靜脈直徑通常≥10微米，毛細(xì)血管≤10微米。在耳部皮膚微血管系統(tǒng)中，血管類型的分布約為9%的小動脈、75%的毛細(xì)血管和16%的小靜脈。然而，皮膚血管的隨機排列使得相似管徑的小動脈和小靜脈難以區(qū)分。為解決這一問題，研究采用了熒光右旋糖酐的分布動力學(xué)分析。通過尾靜脈注射2000 kDa FITC-右旋糖酐后，利用單光子時間推移成像觀察其分布：小動脈在10秒內(nèi)首先顯影，隨后是毛細(xì)血管，最后是小靜脈和靜脈。這種分布模式可通過熱圖可視化，清晰區(qū)分不同血管類型。

血流速度是另一個關(guān)鍵參數(shù)。通過紅細(xì)胞運動速度測量，小動脈的血流速度超過100微米/秒，而小靜脈和毛細(xì)血管均低于100微米/秒。結(jié)合直徑和流速，可準(zhǔn)確識別血管類型。此外，緊密連接蛋白Claudin5（Cldn5）的表達(dá)模式進(jìn)一步細(xì)化了血管分類。免疫染色顯示，Cldn5在小動脈和部分毛細(xì)血管中表達(dá)，而小靜脈表達(dá)缺失。利用Cldn5啟動子驅(qū)動GFP表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型（Cldn5(BAC)-GFP），可直接在活體成像中觀察Cldn5表達(dá)：GFP陽性區(qū)域包括小動脈和部分毛細(xì)血管（稱為陽性毛細(xì)血管），而混合表達(dá)或無表達(dá)的毛細(xì)血管段以及小靜脈則顯示低或無GFP。這種表達(dá)模式與內(nèi)源性Cldn5分布一致，為血管功能研究提供了分子基礎(chǔ)。

驗證實驗顯示，RVDM與XT和fXYT成像的流速估計結(jié)果高度一致，尤其在流速超過20微米/秒時。RVDM的誤差范圍在5-15%之間，與傳統(tǒng)方法相當(dāng)。該工具還可生成整個血管網(wǎng)絡(luò)的速度圖，清晰顯示血管分叉和交匯處的流速變化。RVDM的優(yōu)勢在于僅需單幀圖像即可計算所有血管的流速，且兼容sXYT成像，允許在記錄其他血管事件（如泄漏或擴張）的同時進(jìn)行血流測量。工具通過軟件實現(xiàn)，用戶可輸入掃描參數(shù)和紅細(xì)胞尺寸，自動計算流速，避免了人為偏差。

泄漏動力學(xué)分析顯示，VEGFA注射后約2分鐘內(nèi)開始泄漏（滯后期），隨后熒光強度在血管外增加，6-12分鐘后逐漸停止（泄漏持續(xù)時間）。小分子（如70 kDa菲科爾）的泄漏持續(xù)時間較長（約12分鐘），而大分子（如2000 kDa右旋糖酐）在小靜脈中僅泄漏6分鐘。血管擴張與泄漏同步發(fā)生：小靜脈直徑增加不到1.7倍，而毛細(xì)血管擴張顯著，5分鐘內(nèi)增加三倍，且30分鐘后仍未完全恢復(fù)。血流方面，VEGFA導(dǎo)致小靜脈和毛細(xì)血管的血流速度顯著降低，尤以毛細(xì)血管為甚。這些變化表明，VEGFA通過影響血管張力和血流，調(diào)控微環(huán)境動態(tài)。

創(chuàng)新與亮點
01突破的技術(shù)難題
傳統(tǒng)血管成像技術(shù)如RVFS需多角度掃描，無法兼容并發(fā)動態(tài)事件的記錄。RVDM工具通過單幀圖像分析紅細(xì)胞變形，解決了這一難題，實現(xiàn)了大視野下所有血管流速的同步測量。此外，非侵入性皮內(nèi)刺激方法避免了復(fù)雜手術(shù)（如顱窗植入）可能引發(fā)的炎癥反應(yīng)，確保了血管響應(yīng)的真實性。這些創(chuàng)新克服了以往技術(shù)對高速采集的依賴，為研究快速血管事件提供了可靠平臺。

總結(jié)與展望
本研究通過非侵入性多光子顯微鏡和RVDM分析工具，系統(tǒng)揭示了血管在VEGFA刺激下的動態(tài)響應(yīng)。技術(shù)層面，RVDM實現(xiàn)了流速、泄漏和擴張的同步量化，突破了傳統(tǒng)方法的局限；生物學(xué)層面，發(fā)現(xiàn)了Cldn5表達(dá)與血管功能的相關(guān)性，為靶向治療提供了新靶點。未來，該技術(shù)可應(yīng)用于炎癥、腫瘤等病理模型，探索血管在疾病中的特異性變化。同時，通過優(yōu)化成像參數(shù)，RVDM可適應(yīng)不同血管床的流速范圍，進(jìn)一步拓展其應(yīng)用場景。總之，這項研究不僅推動了血管生物學(xué)的技術(shù)進(jìn)步，也為臨床轉(zhuǎn)化奠定了堅實基礎(chǔ)。

DOI:10.1038/s41467-018-04929-8.