外泌體鑒定過程中WB實驗的注意事項和結(jié)果判斷

外泌體（Exosomes），一種40-160nm的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），來源于多囊泡體（MVB）。多囊泡體與質(zhì)膜融合后，外泌體被釋放到細胞外。外泌體運輸?shù)鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)、核酸和糖，在細胞間通訊中發(fā)揮重要作用。
 
自2013年外泌體領(lǐng)域科學家獲得諾貝爾生理或醫(yī)學獎，外泌體在各個領(lǐng)域的作用都被深入研究。癌癥、心血管、免疫學、體外診斷，隨處可見外泌體身影，它在美容行業(yè)的應(yīng)用也不可小覷。

小優(yōu)給大家推薦過許多外泌體提取方法和試劑、外泌體miRNA知識。想必超速離心、密度梯度離心、沉淀法、膜親和法、免疫磁珠、分子排阻、超濾這些提取方法大家都十分了解。

這次來講一下外泌體的鑒定過程中，WB實驗的注意事項和結(jié)果判斷吧。

我們知道，外泌體表面蛋白包括四萜類、整合素、免疫調(diào)節(jié)蛋白等，CD9、CD81、CD63、flotilin、TSG101、神經(jīng)酰胺等常用作外泌體標記的蛋白質(zhì)。不過，在不同細胞中，它們的含量和表現(xiàn)也不盡相同。那么，在實際的實驗中，它們的結(jié)果都是怎樣的呢？
 
Tsg101
Tsg101最初作為腫瘤抑制因子和負生長調(diào)節(jié)劑被研究者發(fā)現(xiàn)，是轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)體分選復合體（ESCRT-I）的關(guān)鍵成分，參與多囊泡體的生物發(fā)生、外泌體分泌。因此被定為外泌體的標志物之一。
CD9、CD63和CD81
CD9、CD63和CD81屬于四萜類化合物，其特征是四個跨膜結(jié)構(gòu)域和兩個細胞外結(jié)構(gòu)域中最大的一個結(jié)構(gòu)域中的特定折疊。所有細胞類型和組織都表達四萜蛋白的可變組合，其中一些主要存在于質(zhì)膜上，如CD9；有些則存在于細胞內(nèi)，如CD63。這類蛋白被認為是外泌體的特異性標記。然而，有文獻報道，這些蛋白質(zhì)現(xiàn)在也已在凋亡小體和微泡中觀察到。

研究人員用MCF細胞做了實驗，分析了它們在EVs中的相對富集，即它們在EVs中相對于其細胞表達水平的比例。CD63的富集度比CD9低3倍，CD81的富集度平均比CD9高約2倍。與CD63相比，CD9和CD81主要定位在質(zhì)膜上，細胞內(nèi)定位很少。
Calnexin
Calnexin是一種I型整合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，通常位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)溶膠之間。Calnexin陰性被看作獲得較純的外泌體的條件之一。

我們經(jīng)常會看到這樣的報道。CD63和CD81在OM-MSC外泌體中組成性表達，并且在外泌體部分中更豐富。在OM MSC衍生的外泌體中未檢測到陰性外泌體標記物calnexin。
但也有例外。
WB結(jié)果顯示，外泌體標記蛋白CD63和TSGl01在EMS（子宮內(nèi)膜異位癥）外泌體和NHS（正常人樣本）外泌體中均大量表達。在NHS外泌體中未檢測到陰性標記蛋白Calnexin。在EMS外泌體中檢測到少量Calnexin。而我們可以看到，CD63在不同樣本中條帶位置也有細微的差異。
GM130
GM130是一種高爾基體骨架蛋白，與高爾基體膜緊密結(jié)合。研究者提取MSC外泌體，發(fā)現(xiàn)ALIX和CD63存在于EM中。而細胞色素c、GM130和calnexin在細胞裂解物中得到證實，但在EM中沒有。

 

以上就是用WB鑒定外泌體中最常檢測的指標了，大家可要注意下面這些點呀。

01 選擇合適的陰陽標志物作為對照
例如：檢測Tsg101、CD9、CD63、CD81其中2-3個；Calnexin、GM130其中1個，確定外泌體的濃度和純度。

02 與全細胞裂解物做對比
Tsg101、CD9、CD63、CD81這些蛋白也存在于其它細胞膜或細胞質(zhì)，但與外泌體中的含量有差異。通過對比，不僅可以鑒定外泌體，也可以發(fā)現(xiàn)這些指標在發(fā)生病變的細胞中的變化。

03 條帶位置判斷
對比發(fā)現(xiàn)，即使來源相同細胞的細胞器和外泌體，檢測到的Tsg101、CD63等指標的表觀分子量也有所不同。尤其對于CD9、CD63、CD81這些膜蛋白，要放多裁一點膜來觀察它們是否發(fā)生糖基化條帶上移。

參考文獻：
María Yáñez-Mó，Pia R.-M. Siljander，Zoraida Andreu et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles（2015）4：27066.
Raghu Kalluri， Valerie S. LeBleu. The biology, function, and biomedical applications of exosomes (2020) 367(6478): eaau6977.

部分相關(guān)產(chǎn)品：

產(chǎn)品名稱	貨號
Exosomal Marker Antibody Sampler Kit	74220