REPS2通過(guò)自噬介導(dǎo)的β-catenin蛋白的降解抑制腫瘤細(xì)胞的干性

文獻(xiàn)信息
暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生命與健康工程研究所廣東省高校功能蛋白研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和教育部腫瘤分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等單位的研究成果“REPS2 attenuates cancer stemness through inhibiting Wnt signaling by autophagy mediated degradation of β-catenin（REPS2通過(guò)自噬介導(dǎo)的β-catenin蛋白的降解來(lái)抑制Wnt信號(hào)通路從而抑制腫瘤細(xì)胞的干性）在雜志《Oncogene》（IF：7.3）上發(fā)表。平生公司的活體CT（Super nova）在論文中提供了重要的小鼠肺部腫瘤圖像。

該研究的通訊作者陳良教授，第一作者為劉鷺老師。

文獻(xiàn)背景
調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞干性的腫瘤抑癌基因（TSG）仍有待確定。作者利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的全基因組規(guī)模的關(guān)于肺癌干性基因的篩選，并確定REPS2是一種有效的TSG，對(duì)肺癌細(xì)胞的干性進(jìn)行負(fù)調(diào)控。其抑癌作用在體外和體內(nèi)都得到了證實(shí)。從機(jī)制上講，P62同時(shí)與β-catenin和REPS2相互作用，導(dǎo)致自噬溶酶體介導(dǎo)的β-catenin的降解從而抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。β-catenin的抑制劑與驅(qū)動(dòng)突變抑制劑協(xié)同誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡，可用于提高腫瘤免疫治療的療效。

實(shí)驗(yàn)方法
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
對(duì)于異種移植瘤模型，在6-8周齡的雌性裸鼠皮下植入2×10⁶個(gè)A549細(xì)胞系，這些細(xì)胞系具有通過(guò)CRISPR篩選敲除的前10個(gè)候選基因。將小鼠隨機(jī)分為幾組，每組三只。4周后，處死小鼠并解剖腫瘤負(fù)荷。對(duì)于LLC異種移植瘤模型，在6-8周齡的雌性WT小鼠上皮下接種2×10⁶ LLC（Vehicle或OE REPS2）。將小鼠隨機(jī)分組，每組4只。腫瘤體積達(dá)到100mm³時(shí)進(jìn)行測(cè)量。2周后，處死小鼠并解剖腫瘤負(fù)荷。

將過(guò)表達(dá)REPS2（KC+R）或Vehicle的逆轉(zhuǎn)錄病毒通過(guò)鼻孔吸入6-8周齡的TetO-KrasG12D/CC10rtTA（指定為KC）雙轉(zhuǎn)基因雌性小鼠的肺部。將小鼠隨機(jī)分組，每組4只。所有小鼠均喂食含有Dox的食物3個(gè)月。計(jì)算機(jī)斷層掃描（Super nova CT，平生醫(yī)療科技有限公司）用于量化腫瘤負(fù)荷。

將含有Cre和Cas9的慢病毒注入6-8周齡的LSLKRASG12D雌性小鼠的肺部。感染后6個(gè)月，通過(guò)CT監(jiān)測(cè)REPS2基因敲除小鼠（K-sgREPS2小鼠）和TdTomato基因敲除鼠（K-sgTD小鼠作為對(duì)照）的腫瘤負(fù)荷。對(duì)于K-sgREPS2小鼠治療，將小鼠隨機(jī)分為幾組，每組4只。用ICG001（腹膜內(nèi)注射，25mg/kg/天）、曲美替尼（強(qiáng)飼，1mg/kg/天）和PD-1抗體（腹膜內(nèi)注入，5mg/kg/天）治療小鼠2周。通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層掃描監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
REPS2在體內(nèi)肺癌小鼠模型中是一種有效的腫瘤抑制因子
將REPS2過(guò)表達(dá)LLC細(xì)胞的同種異體移植腫瘤（LLC-REPS2oe）的生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照細(xì)胞（圖4A）。此外，作者發(fā)現(xiàn)REPS2的過(guò)表達(dá)顯著抑制了CD44的表達(dá)（圖S4A）。小鼠原位肺癌模型更好地再現(xiàn)了患者腫瘤發(fā)展的臨床過(guò)程。前期，作者報(bào)道了一種肺癌小鼠模型TetO-KrasG12D；CC10rtTA（指定為KC小鼠），在四環(huán)素飲食誘導(dǎo)（Dox）3個(gè)月之后，由KrasG12D驅(qū)動(dòng)發(fā)展為肺癌。然后，作者通過(guò)鼻內(nèi)滴注（指定為KC+R）用含有Teton-REPS2的慢病毒感染這些小鼠。WB分析證實(shí)了Dox誘導(dǎo)3個(gè)月后KC+R小鼠肺組織中REPS2的表達(dá)（圖S4B）。作者發(fā)現(xiàn)REPS2的過(guò)度表達(dá)顯著抑制了肺癌的形成（圖4B–F）。蘇木精和伊紅（H&E）染色檢查顯示，REPS2的過(guò)度表達(dá)顯著抑制了KC+R小鼠肺癌的形成（圖4B）。此外，作者發(fā)現(xiàn)REPS2的過(guò)表達(dá)顯著抑制了對(duì)CD44的表達(dá)（圖S4C）。相反，按照先前報(bào)道的通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在Lsl-KrasG12D轉(zhuǎn)基因小鼠的肺癌小鼠模型中敲除腫瘤抑制基因的程序，作者將靶向Td-tomato（作為陰性對(duì)照，K-sgTD）或REPS2（K-sgREPS2）的慢病毒鼻內(nèi)遞送到Lsl-KrasG12D小鼠中。與對(duì)照組相比，經(jīng)鼻吸入慢病毒6個(gè)月后，作者檢測(cè)到REPS2敲除小鼠的腫瘤負(fù)荷、腫瘤數(shù)量、最大腫瘤直徑和III期腫瘤數(shù)量顯著增加（圖4G-K）。此外，作者通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)到REPS2敲除的腫瘤中CD44的表達(dá)顯著升高（圖S4D，E）。

圖4 REPS2在體內(nèi)肺癌小鼠模型中是一種有效的腫瘤抑制因子。A. REPS2過(guò)表達(dá)對(duì)LLC異種移植物腫瘤的影響。腫瘤體積和腫瘤重量統(tǒng)計(jì)如下。B.REPS2過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠原位肺腫瘤形成的影響。相應(yīng)的HE分析圖像如下所示。C-F.腫瘤負(fù)荷、腫瘤數(shù)量、最大腫瘤大小和腫瘤III期數(shù)量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。G.敲除REPS2對(duì)Lsl-KrasG12D小鼠腫瘤形成的影響。相應(yīng)的HE分析圖像如下所示。H-K腫瘤負(fù)荷、腫瘤數(shù)量、最大腫瘤大小和腫瘤III期數(shù)量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

聯(lián)合抑制WNT/β-catenin通路和MEK增強(qiáng)REPS2缺陷/Kras突變型肺癌免疫治療

作者生成了一批攜帶K-sgREPS2肺癌的小鼠，并用ICG001、曲美替尼和PD-1抗體治療這些小鼠2周。作者發(fā)現(xiàn)，與ICG001和曲美替尼的組合相比，ICG001、曲美替尼和PD-1抗體治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)（圖7E、F）。此外，F(xiàn)ACS分析顯示，聯(lián)合治療顯著增加了腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)（圖7G，H）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，ICG001、曲美替尼和PD-1抗體的組合有效地抑制了KrasG12D/REPS2-/-肺癌。

圖7 聯(lián)合抑制WNT/β-catenin通路和MEK增強(qiáng)REPS2缺陷/Kras突變肺癌免疫治療。E .ICG001、曲美替尼和PD-1抗體聯(lián)合治療可有效縮小K-sgREPS2小鼠的肺腫瘤。相關(guān)HE分析如下所示。F.用（E）的聯(lián)合療法治療的小鼠腫瘤負(fù)荷的定量。

文獻(xiàn)結(jié)論

免疫療法改變了當(dāng)前臨床腫瘤學(xué)實(shí)踐的范式。不幸的是，大多數(shù)患者未能從免疫療法中受益。典型免疫療法的組合，如PD-1抑制劑和CTLA4抑制劑之間、PD-1和LAG3之間以及PD-1和TIGIT之間，正在臨床試驗(yàn)中積極測(cè)試。免疫療法也與化療和靶向治療相結(jié)合。然而，在上述所有組合中，耐藥性仍然是一個(gè)棘手的問(wèn)題。作者目前的工作為一個(gè)研究不足的領(lǐng)域提供了新的思路：通過(guò)識(shí)別強(qiáng)效TSG的功能喪失并闡明隨之而來(lái)的異常信號(hào)，研究人員可以識(shí)別由這種異常信號(hào)產(chǎn)生的藥物靶點(diǎn)。因此，考慮到這些藥物與免疫療法的潛在聯(lián)合，可能會(huì)導(dǎo)致治療效果的增強(qiáng)。

使用設(shè)備

     
Micro CT（型號(hào)：Super Nova）（平生醫(yī)療科技）
 影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）