​蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)——樣本前處理詳細(xì)操作流程

🔥做蛋白質(zhì)組學(xué)總踩坑？90%問題出在樣本前處理！這份保姆級(jí)流程快收好，從源頭保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量～
 ►Tips：本文涉及的方法僅供學(xué)習(xí)參考，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際樣本進(jìn)行調(diào)整！
① 樣本收集&保存：關(guān)鍵第一步！

• 核心原則：全程低溫（4℃/冰浴）操作，減少蛋白氧化、降解；按“單次實(shí)驗(yàn)用量”分裝，避免反復(fù)凍融（≤3次）！

（1）細(xì)胞樣本（貼壁/懸浮細(xì)胞）

• 貼壁細(xì)胞收集：

1. 棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS（含1%雙抗）輕柔洗2次（每次5mL，避免沖散細(xì)胞）；
2. 加0.25%胰酶（覆蓋細(xì)胞層即可），37℃孵育1-2min至細(xì)胞皺縮，加2倍體積含血清培養(yǎng)基終止消化；
3. 用移液管吹打細(xì)胞（8-10次，避免產(chǎn)生過多氣泡），收集至15mL離心管，4℃、1000rpm離心5min；
4. 棄上清，加5mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，4℃、1000rpm離心5min（重復(fù)2次），最終留細(xì)胞沉淀（約1×10⁶-1×10⁷個(gè)細(xì)胞/管）。

• 懸浮細(xì)胞收集：

1. 直接收集細(xì)胞懸液至15mL離心管，4℃、800rpm離心5min；
2. 棄上清，加5mL預(yù)冷PBS重懸，4℃、800rpm離心5min（重復(fù)2次），留細(xì)胞沉淀。

• 保存方式：細(xì)胞沉淀加100μLPBS），分裝至EP管，-80℃凍存（建議保存時(shí)間低于6個(gè)月），如長(zhǎng)期保存需加10%DMSO，避免細(xì)胞破裂導(dǎo)致蛋白釋放。

（2）組織樣本（動(dòng)物/植物/微生物）

• 動(dòng)物組織（如肝臟、肌肉等）

1. 取材后立即放入預(yù)冷生理鹽水（含蛋白酶抑制劑）中，用無菌剪刀去除筋膜、脂肪，剪成1mm³小塊（每塊約芝麻大小，避免擠壓損傷細(xì)胞）（如不立即處理，取樣后立即-80℃凍存）；
2. 取50-100mg組織塊放入研磨管，加500μL預(yù)冷裂解液（按組織重量1:5比例加），冰浴下用組織研磨儀研磨（務(wù)必在冰浴中進(jìn)行，避免升溫）；
3. 研磨后轉(zhuǎn)移至EP管，冰上靜置30min（讓蛋白充分溶出），分裝-80℃保存。

• 植物組織（如葉片、根系）

1. 先將組織放入液氮中快速冷凍（10-20s），研磨成粉末（避免回溫，可分批次加液氮保持低溫）；
2. 取100mg粉末，加600μL含 PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮，1%終濃度）的裂解液（去除植物多酚干擾），冰浴渦旋30s，4℃靜置30min。

• 微生物（細(xì)菌/真菌）

1. 細(xì)菌：培養(yǎng)至OD600=0.8-1.0，4℃、5000rpm離心10min，棄上清，加500μL含溶菌酶（1mg/mL）的裂解液，37℃孵育20min（破壞細(xì)胞壁）；
2. 真菌：收集菌絲體，加玻璃珠（0.5mm直徑）和500μL裂解液，渦旋振蕩（3000rpm，5min），破碎細(xì)胞壁。

（3）體液樣本（血清/血漿/尿液/腦脊液）

• 血清/血漿：

1. 血液采集后，血清管（無抗凝劑）室溫靜置30min，血漿管（加EDTA/K₂抗凝，1:10比例）立即顛倒混勻5次；
2. 4℃、3000rpm離心15min，取上層血清/血漿（避免吸到中間白細(xì)胞層），分裝至EP管（每管50-100μL）,-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。

• 尿液/腦脊液：

1. 收集新鮮樣本，4℃、4000rpm離心20min，去除沉淀（如細(xì)胞、雜質(zhì)）；
2. 取上清，加蛋白酶抑制劑（1:100比例），分裝后-80℃凍存（尿液需加0.05%疊氮鈉防腐）。 

• 踩坑預(yù)警：①組織研磨時(shí)未冰浴，溫度升高導(dǎo)致蛋白變性；② 血清離心時(shí)轉(zhuǎn)速過低（<2500rpm），未完全分離血細(xì)胞；③ 尿液未及時(shí)離心，細(xì)菌繁殖降解蛋白！

② 蛋白裂解&提�。喊葱柽x方法

• 核心目標(biāo)：充分裂解細(xì)胞/組織，釋放蛋白，同時(shí)抑制蛋白酶活性，避免蛋白修飾（如磷酸化丟失）。

• 通用添加劑（必加！）：✅蛋白酶抑制劑cocktail（1:100比例，如PMSF、抑肽酶，抑制絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶等）；✅磷酸酶抑制劑（1:100比例，提取磷酸化蛋白時(shí)加，非磷酸化可省略）；

（2）具體操作技巧：分樣本細(xì)化

• 細(xì)胞樣本裂解

1. 取收集的細(xì)胞沉淀，加預(yù)冷裂解液（按1×10⁶細(xì)胞加50μL裂解液，1×10⁷細(xì)胞加100μL），渦旋混勻10s；
2. 冰浴孵育30min（每10min渦旋1次，促進(jìn)蛋白溶出）；
3. 4℃、12000rpm離心15min，取上清（含總蛋白），轉(zhuǎn)移至新EP管（避免吸到管底沉淀，沉淀為細(xì)胞碎片）。

• 組織樣本裂解

1. 取研磨后的組織勻漿液（如100mg組織+500μL裂解液），冰浴孵育40min（每15min渦旋1次）；
2. 4℃、13000rpm離心20min（轉(zhuǎn)速高于細(xì)胞裂解，去除組織纖維沉淀），取上清。

• 微生物樣本裂解：

1. 細(xì)菌：溶菌酶孵育后，加裂解液冰浴30min，4℃、10000rpm離心15min；
2. 真菌：玻璃珠破碎后，加裂解液冰浴40min，4℃、12000rpm離心20min，取上清。

③ 蛋白定量：標(biāo)準(zhǔn)化上樣量

• 常用方法1：BCA法

✅ 優(yōu)點(diǎn)：兼容去污劑（如SDS、Triton X-100，不用額外除裂解液成分）；線性范圍寬（20-2000μg/mL，適合高低濃度樣本）；顯色穩(wěn)定（孵育后1小時(shí)內(nèi)吸光度變化小，可批量測(cè)）。
⚠️缺點(diǎn)：受EDTA影響（會(huì)螯合銅離子，降低顯色強(qiáng)度）；部分蛋白（如組蛋白）反應(yīng)弱，可能導(dǎo)致結(jié)果偏低。

• 常用方法2：Bradford法

✅優(yōu)點(diǎn)：速度快（5分鐘顯色，無需長(zhǎng)時(shí)間孵育）；對(duì)鹽、尿素耐受度高（雜質(zhì)輕微時(shí)不影響）；試劑成本低。
⚠️缺點(diǎn)：嚴(yán)重受去污劑干擾（如RIPA裂解液中的 Triton X-100會(huì)讓結(jié)果偏高/假陽性）；線性范圍窄（20-1000μg/mL，高濃度需稀釋）；顯色不穩(wěn)定（孵育后30分鐘內(nèi)必須測(cè)，否則吸光度下降）。
選擇技巧：用含去污劑的裂解液（如RIPA）選BCA法；樣本雜質(zhì)少、想快速粗略定量選Bradford法！

• 操作要點(diǎn)：做標(biāo)準(zhǔn)曲線→加樣本孵育→測(cè)吸光度→計(jì)算蛋白濃度，確保所有樣本濃度一致！

④ SDS-PAGE 驗(yàn)證：檢測(cè)蛋白質(zhì)量（關(guān)鍵質(zhì)控步！）

• 核心目的：驗(yàn)證蛋白是否降解、有無雜帶污染，確保后續(xù)酶切樣本質(zhì)量合格。
• 操作流程：

1. 樣品制備：按定量結(jié)果取20-30μg蛋白，加5×SDS上樣緩沖液（含β-巰基乙醇），95℃煮沸5min使蛋白變性；
2. 凝膠配制：制備5%濃縮膠（堆積蛋白）和10%-12%分離膠（按分子量分離，小分子選高濃度膠），室溫靜置20-30min待凝膠聚合；
3. 上樣電泳：加電泳緩沖液，先上蛋白Marker（用于分子量參考），再依次上樣樣本，80V跑濃縮膠（約30min，至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠），轉(zhuǎn)120V跑分離膠（60-90min，至溴酚藍(lán)達(dá)凝膠底部）；
4. 染色觀察：凝膠用0.1%考馬斯亮藍(lán)或銀染試劑搖床染色1-2h，再用脫色液（甲醇：水: 冰醋酸 = 4:5:1）脫色至條帶清晰。
5. 結(jié)果判斷：✅合格：條帶分布均勻、無明顯拖尾（無降解）、無額外雜帶（無污染）；❌不合格：出現(xiàn)彌散拖尾（蛋白降解）、條帶偏少（提取不完全），需重新處理樣本！

⑤ 胰酶酶切：將蛋白切成肽段（質(zhì)譜檢測(cè)關(guān)鍵步）

還原烷基化先加DTT或者TCEP還原二硫鍵（56℃孵育 30min），再加碘乙酰胺烷基化（避光室溫 20min），防止蛋白復(fù)性影響酶切。

• 酶切操作：

1. 按蛋白：胰酶=50:1或100:1的比例加酶（胰酶需用NH₄HCO₃緩沖液溶解）；
2. 37℃恒溫孵育12-16h（可放搖床輕微震蕩，提升酶切效率）
3. 終止反應(yīng)加甲酸至終濃度1%（pH<3），終止胰酶活性。

⑥ 肽段除鹽：為質(zhì)譜“掃清障礙”

• 目的：去除酶切后殘留的鹽類、去污劑、未酶切完全的蛋白，避免干擾質(zhì)譜信號(hào)。
• 常用方法：C18固相萃取柱（或自制StageTip）
• 常用步驟（可根據(jù)實(shí)際條件調(diào)整）：柱活化（加甲醇）→平衡（加0.1%甲酸水溶液）→上樣肽段→清洗雜質(zhì)（0.1%甲酸水溶液洗去雜質(zhì)）→洗脫（80%乙腈+0.1%甲酸溶液收集肽段）
• 踩坑預(yù)警：洗脫后需真空濃縮（避免高溫），將乙腈去除，再用0.1%甲酸復(fù)溶，控制復(fù)溶后的肽段濃度約1μg/μL！

 
💡最后總結(jié)：

• 樣本前處理核心是“防降解、去雜質(zhì)、準(zhǔn)定量、高效酶切”，從樣本到肽段的每一步都決定數(shù)據(jù)質(zhì)量！后續(xù)質(zhì)譜檢測(cè)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，全靠這步打底～

 

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