活細(xì)胞表面賴氨酸足跡法捕捉病毒誘導(dǎo)的構(gòu)象動力學(xué)并揭示甲流宿主因子

細(xì)胞表面配體-受體相互作用及其構(gòu)象動態(tài)變化是調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答與病毒感染等生理與病理過程的核心機制。對這些受體進(jìn)行功能鑒定與表征，為理解生命活動的基本規(guī)律和靶向藥物研發(fā)提供了重要基礎(chǔ)。然而，現(xiàn)有研究方法缺乏空間特異性，難以在活細(xì)胞中捕捉蛋白質(zhì)組水平動態(tài)結(jié)構(gòu)重構(gòu)。因此，解析病毒與宿主在細(xì)胞表面的相互作用動態(tài)，至今仍是一項重要的科學(xué)挑戰(zhàn)。2026年1月，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院化學(xué)與肝癌研究所張瑩/陸豪杰團(tuán)隊與浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院傳染病診療國家重點實驗室陳建團(tuán)隊在JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY上發(fā)表了題為“Living Cell Surfacome Lysine Footprinting (LiFT) Captures Virus-Induced Conformational Dynamics and Uncovers Influenza A Virus Host Factors”的研究。作者開發(fā)了一種名為LiFT的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)新策略。該方法通過探測細(xì)胞外賴氨酸的可及性變化，實現(xiàn)對配體誘導(dǎo)構(gòu)象變化的直接、高特異性圖譜繪制。應(yīng)用于甲型流感病毒(IAV)與宿主細(xì)胞的互作研究，鑒定出了新的病毒宿主因子，并為理解病毒侵染和受體生物學(xué)研究提供了新視角。本文使用的PEAKS Online作為蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析軟件，從質(zhì)譜數(shù)據(jù)中鑒定和定量細(xì)胞表面蛋白的賴氨酸修飾，是實驗數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為生物學(xué)發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵工具。  

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方法創(chuàng)新
LiFT技術(shù)的核心在于使用細(xì)胞表面特異性化學(xué)探針OPA-S-S-alkyne。該探針可特異性結(jié)合活細(xì)胞外膜蛋白的賴氨酸殘基。當(dāng)配體與細(xì)胞表面受體發(fā)生相互作用時，受體構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其表面賴氨酸殘基的可及性產(chǎn)生差異。通過LC-MS/MS分析，比較標(biāo)記肽段的質(zhì)譜峰面積，可精準(zhǔn)捕獲這種賴氨酸可及性的動態(tài)變化，進(jìn)而實現(xiàn)互作界面定位與構(gòu)象動態(tài)解析。該探針包括富集基團(tuán)和可切割基團(tuán)，能夠有效地從復(fù)雜的生物樣品中分離低豐度的膜蛋白，從而提高了對罕見或弱相互作用的表面蛋白構(gòu)象變化的檢測靈敏度。

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LiFT技術(shù)的系統(tǒng)性驗證
為驗證LiFT的有效性，研究者在兩種經(jīng)典模型系統(tǒng)中進(jìn)行了測試。首先在人血清白蛋白(HSA)-布洛芬的體系中，LiFT通過質(zhì)譜分析精準(zhǔn)捕捉到了布洛芬結(jié)合口袋周圍賴氨酸可及性的特異性改變，其結(jié)果與已知晶體結(jié)構(gòu)高度吻合，證明了LiFT在檢測配體誘導(dǎo)構(gòu)象變化方面具有高靈敏度與空間分辨率。

進(jìn)一步在活細(xì)胞體系中，作者應(yīng)用LiFT研究表皮生長因子(EGF)與其受體EGFR的相互作用。成功監(jiān)測到EGF刺激后EGFR胞外域多個賴氨酸殘基的可及性發(fā)生改變。全局分析顯示，除了EGFR本身，還有49個細(xì)胞表面蛋白的賴氨酸標(biāo)記也發(fā)生顯著變化。功能富集分析表明，這些蛋白顯著富集于與EGFR相關(guān)的通路。此外，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示EGFR在互作網(wǎng)絡(luò)的核心地位，且超過一半的響應(yīng)蛋白在公共數(shù)據(jù)庫中已被記錄為EGFR的相互作用因子。這些結(jié)果表明LiFT能夠特異性識別細(xì)胞表面的配體-受體相互作用以及相關(guān)構(gòu)象變化。

圖1.通過賴氨酸可及性分析，LiFT能夠靈敏地檢測到配體誘導(dǎo)的HSA構(gòu)象變化

圖2.LiFT捕捉到EGF誘導(dǎo)的活細(xì)胞表面的構(gòu)象變化

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IAV宿主因子的篩選與驗證
基于上述驗證，研究者將LiFT應(yīng)用于甲型流感病毒（IAV）與宿主細(xì)胞之間的相互作用，完成了病毒在A549細(xì)胞表面附著過程誘導(dǎo)的構(gòu)象變化圖譜。質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示，IAV結(jié)合引發(fā)了廣泛的賴氨酸可及性變化，涉及大量細(xì)胞表面蛋白。功能分析表明這些蛋白富集于“病毒受體活性”和“共生體侵入宿主細(xì)胞”等條目，提示其高度參與病毒感染過程。

鑒于唾液酸在IAV感染中的作用已得到證實，通過整合構(gòu)象數(shù)據(jù)和定量唾液酸譜，證明了許多表現(xiàn)出病毒誘導(dǎo)的可及性變化的蛋白質(zhì)是高度唾液酸化的，支持唾液酸在調(diào)節(jié)IAV附著中的作用。
 

圖3.LiFT能夠在系統(tǒng)范圍內(nèi)分析IAV附著時細(xì)胞表面的構(gòu)象變化

除了已知的IAV附著因子外，LiFT還新識別一種參與病毒進(jìn)入的宿主因子—胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)。CRISPR/Cas9敲除IGF1R顯著降低了IAV的感染效率，而重新表達(dá)該蛋白則能完全恢復(fù)病毒易感性，證明了表型的特異性。在天然對IAV感染具有抵抗性的Lec1細(xì)胞（一種糖基化缺陷型CHO細(xì)胞）中異源表達(dá)IGF1R，能夠顯著提升該細(xì)胞對病毒的易感性，證明IGF1R促進(jìn)細(xì)胞對IAV的感染。

在機制上，研究通過分子對接與免疫共沉淀，證實了IGF1R胞外域與病毒血凝素(HA)的直接互作。此類膜蛋白-病毒蛋白的瞬時結(jié)合因技術(shù)所限此前少有報道，凸顯了LiFT的技術(shù)優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，IGF1R缺陷細(xì)胞呈現(xiàn)α-2,6-唾液酸化水平下降與病毒附著受損的關(guān)聯(lián)表型；同時，可溶性IGF1R胞外域可競爭性抑制HA與細(xì)胞的結(jié)合，為其作為功能性受體提供了直接證據(jù)。

最后，靶向干預(yù)實驗顯示，IGF1R特異性中和抗體及多種小分子抑制劑，均能在體外有效且選擇性地抑制IAV感染。這些遺傳、生化與藥理學(xué)數(shù)據(jù)共同確立了IGF1R是介導(dǎo)IAV早期感染的關(guān)鍵宿主因子，并初步驗證了其作為抗病毒靶點的潛力。

圖4.IGF1R作為IAV附著因子的功能驗證

圖5.IGF1R作為IAV的結(jié)合與入侵因子發(fā)揮作用

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總結(jié)
總結(jié)而言，LiFT技術(shù)作為一種新型化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)工具，實現(xiàn)了活細(xì)胞表面配體-受體相互作用及構(gòu)象動態(tài)的分析，彌補了傳統(tǒng)方法在生理環(huán)境互作檢測中的不足。此外，LiFT技術(shù)具有廣泛的適用性，可拓展至小分子藥物-蛋白互作、病毒-宿主互作、免疫細(xì)胞識別等多個研究領(lǐng)域，為生物機制解析與治療靶點發(fā)現(xiàn)提供強大技術(shù)支撐，有望推動相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

文獻(xiàn)鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c14196

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