一種結(jié)合QIS相機(jī)和開普勒望遠(yuǎn)鏡啟發(fā)的光學(xué)設(shè)計(jì)的新型顯微鏡技術(shù)

生物發(fā)光成像作為熒光成像的有力替代方案，因其無需激發(fā)光源、背景低、光毒性小等優(yōu)勢(shì)，在活細(xì)胞研究中具有巨大潛力。然而，生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度弱，限制了其廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)生物發(fā)光顯微鏡通常犧牲空間分辨率、視場(chǎng)和動(dòng)態(tài)范圍來提升靈敏度，主要受限于電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）相機(jī)的性能。近期，量子圖像傳感器（QIS）技術(shù)的出現(xiàn)為低光成像帶來了新機(jī)遇。本文介紹了一種結(jié)合QIS相機(jī)和開普勒望遠(yuǎn)鏡啟發(fā)的光學(xué)設(shè)計(jì)的新型顯微鏡——“QIScope”。該系統(tǒng)在保持較高信噪比的同時(shí)，顯著提升了空間分辨率、視場(chǎng)和動(dòng)態(tài)范圍，使生物發(fā)光成像能夠用于挑戰(zhàn)性活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如同時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)外的囊泡動(dòng)態(tài)或低豐度蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)過程。這一突破為長(zhǎng)時(shí)程、高精度活細(xì)胞成像提供了新工具。

本研究成果由Ruyu Ma、Luciano M. Santino、Tomás Chobola、Niklas Armbrust、Julian Geilenkeuser、Sapthagiri Sukumaran、Zhizi Jing、Anastasia Levkina、Korneel Ridderbeek、Tingying Peng、Dong-Jiunn Jeffery Truong、Sebastian Doll、Gil Gregor Westmeyer和Jian Cui等研究者共同完成。論文題為“A telescopic microscope equipped with a quanta image sensor for live-cell bioluminescence imaging”，于2025年《Nature Methods》期刊上在線發(fā)表。該研究通過創(chuàng)新光學(xué)設(shè)計(jì)解決了生物發(fā)光成像的長(zhǎng)期瓶頸，為生物醫(yī)學(xué)研究開辟了新路徑。

重要發(fā)現(xiàn)
01核心貢獻(xiàn)：QIS相機(jī)的靈敏度超越傳統(tǒng)探測(cè)器
研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)QIS相機(jī)與主流科學(xué)相機(jī)進(jìn)行了系統(tǒng)基準(zhǔn)測(cè)試。比較對(duì)象包括科學(xué)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（sCMOS）相機(jī)和EMCCD相機(jī)，這些相機(jī)長(zhǎng)期以來被視為低光成像的金標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)在相同的自制熒光顯微鏡平臺(tái)上進(jìn)行，通過中性密度濾光片調(diào)節(jié)光子通量 per pixel，確保公平比較。結(jié)果顯示，在相同光子條件下，QIS相機(jī)的信噪比（SNR）達(dá)到EMCCD的4.5倍、sCMOS的近10倍。這一優(yōu)勢(shì)在量子點(diǎn)標(biāo)記的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成像中得到驗(yàn)證，QIS相機(jī)能清晰分辨弱信號(hào)結(jié)構(gòu)，而傳統(tǒng)相機(jī)則出現(xiàn)模糊或噪聲干擾。

然而，QIS相機(jī)的小像素尺寸和有限傳感器面積帶來了新挑戰(zhàn)：直接替換到傳統(tǒng)顯微鏡會(huì)導(dǎo)致光子通量 per pixel 大幅下降，視場(chǎng)嚴(yán)重縮小。例如，QIS傳感器面積僅為20.25 mm²，比sCMOS（224.28 mm²）小10倍以上，比EMCCD（67.11 mm²）小3倍以上。這表明，單純使用QIS相機(jī)不足以發(fā)揮其潛力，必須重新設(shè)計(jì)光學(xué)系統(tǒng)以匹配其特性。

與商業(yè)頂級(jí)生物發(fā)光顯微鏡（基于EMCCD）的直接對(duì)比顯示，QIScope的視場(chǎng)擴(kuò)大3.6倍（可視面積提升13倍），空間分辨率提高1.77倍（理論值1.89倍），且信噪比提升31%。調(diào)制傳遞函數(shù)（MTF）分析證實(shí)了分辨率的優(yōu)勢(shì)。此外，QIScope的動(dòng)態(tài)范圍比EMCCD系統(tǒng)高4.5倍，避免了信號(hào)飽和問題，使其能同時(shí)捕捉強(qiáng)弱信號(hào)區(qū)域。

更重要的是，QIScope實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞外囊泡（EVs）的高質(zhì)量成像。EVs是細(xì)胞間通信的關(guān)鍵載體，但其異質(zhì)性（尺寸從納米到微米、動(dòng)態(tài)范圍廣）使成像極具挑戰(zhàn)。在表達(dá)NLuc-CD63（外泌體標(biāo)記）的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，QIScope能清晰分辨細(xì)胞外線性軌跡中的小EVs，并跟蹤其擴(kuò)散動(dòng)態(tài)（時(shí)間分辨率達(dá)2秒），而傳統(tǒng)系統(tǒng)僅能檢測(cè)到大EVs。通過去噪算法（如Noise2Info）進(jìn)一步提升了圖像質(zhì)量。此外，QIScope的長(zhǎng)時(shí)程成像能力（超過18小時(shí)）避免了光毒性和探針光漂白，適用于持續(xù)監(jiān)測(cè)。

在低豐度蛋白質(zhì)成像方面，QIScope成功記錄了PTEN誘導(dǎo)激酶1（PINK1）的線粒體易位過程。PINK1在受損線粒體上穩(wěn)定表達(dá)，但其基礎(chǔ)水平極低。傳統(tǒng)顯微鏡難以分辨其亞細(xì)胞分布變化，而QIScope結(jié)合高分辨率物鏡（100×油鏡）清晰顯示了PINK1從胞質(zhì)到線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，為神經(jīng)退行性疾病研究提供了新洞察。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破成像難題：兼顧靈敏度、分辨率與視場(chǎng)
生物發(fā)光成像的核心難題在于如何平衡靈敏度、空間分辨率和視場(chǎng)。傳統(tǒng)系統(tǒng)往往以犧牲某一參數(shù)為代價(jià)，例如EMCCD相機(jī)雖靈敏度高，但動(dòng)態(tài)范圍窄、易飽和；sCMOS相機(jī)雖分辨率高，但低光性能不足。QIScope通過量子圖像傳感器的高轉(zhuǎn)換增益和低噪聲特性，實(shí)現(xiàn)了單光子級(jí)別檢測(cè)，同時(shí)望遠(yuǎn)鏡光學(xué)設(shè)計(jì)解決了小傳感器帶來的視場(chǎng)限制。這一創(chuàng)新使系統(tǒng)在信噪比適度提升的基礎(chǔ)上，大幅突破分辨率與視場(chǎng)瓶頸，為活細(xì)胞成像提供了“魚與熊掌兼得”的解決方案。

02技術(shù)價(jià)值：多模態(tài)集成與長(zhǎng)時(shí)程成像優(yōu)勢(shì)
QIScope的模塊化設(shè)計(jì)允許輕松集成其他成像模式。例如，通過在望遠(yuǎn)鏡組中插入分光鏡和濾光片，實(shí)現(xiàn)了生物發(fā)光與熒光雙模態(tài)成像。實(shí)驗(yàn)顯示，同一細(xì)胞中CD63標(biāo)記的EVs（生物發(fā)光）與MitoTracker標(biāo)記的線粒體（熒光）可被同時(shí)監(jiān)測(cè)，且無背景干擾。這種多模態(tài)能力擴(kuò)展了應(yīng)用場(chǎng)景，如研究代謝狀態(tài)或藥物響應(yīng)下的細(xì)胞器互作。

相比熒光成像，生物發(fā)光在低豐度目標(biāo)檢測(cè)中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。在誘導(dǎo)表達(dá)Gamillus-NLuc融合蛋白的細(xì)胞中，熒光信號(hào)在低表達(dá)水平時(shí)被自體熒光掩蓋，而生物發(fā)光信號(hào)仍清晰可辨。此外，長(zhǎng)時(shí)程成像中，熒光探針易光漂白并引發(fā)光毒性，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變；生物發(fā)光則穩(wěn)定性高，支持超過18小時(shí)的連續(xù)觀測(cè)，適用于動(dòng)態(tài)過程研究（如PINK1易位）。

總結(jié)與展望
本研究開發(fā)的QIScope系統(tǒng)通過融合量子圖像傳感器與望遠(yuǎn)鏡光學(xué)設(shè)計(jì)，成功提升了生物發(fā)光成像的性能，使其在靈敏度、分辨率、視場(chǎng)和動(dòng)態(tài)范圍上均優(yōu)于傳統(tǒng)方法。該系統(tǒng)不僅解決了低光成像的長(zhǎng)期挑戰(zhàn)，還通過多模態(tài)集成和長(zhǎng)時(shí)程穩(wěn)定性，為活細(xì)胞研究提供了強(qiáng)大工具。未來，隨著更亮熒光素酶底物（如氟呋喃嗪）的應(yīng)用，QIScope的信噪比和分辨率可進(jìn)一步提升；同時(shí)，其開放架構(gòu)便于整合單光子陣列探測(cè)器或新一代QIS相機(jī)，拓展時(shí)間飛行成像等新功能。展望未來，QIScope有望成為生物發(fā)光成像的標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)，促進(jìn)其在精準(zhǔn)醫(yī)療、藥物開發(fā)和基礎(chǔ)生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用，最終實(shí)現(xiàn)與蛋白質(zhì)組學(xué)或電鏡等技術(shù)的無縫融合。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Ma R, Santino LM, Chobola T, Armbrust N, Geilenkeuser J, Sukumaran S, Jing Z, Levkina A, Ridderbeek K, Peng T, Truong DJ, Doll S, Westmeyer GG, Cui J. A telescopic microscope equipped with a quanta image sensor for live-cell bioluminescence imaging. Nat Methods. 2025 Jun;22(6):1321-1330.

DOI:10.1038/s41592-025-02694-3.