雙光子-光聲顯微鏡同步實現(xiàn)微血管140μm與神經(jīng)元>300μm深層成像

重要發(fā)現(xiàn)
01核心貢獻：高速、大體積活體深組織三維成像
本研究的核心貢獻在于創(chuàng)造性地將雙光子激發(fā)（2PE）技術(shù)與光片照明（Light-sheetillumination）相結(jié)合，構(gòu)建了一種新型顯微鏡系統(tǒng)——雙光子光片顯微鏡（2P-LSM）。這一技術(shù)突破性地解決了在活體組織中，特別是在大腦皮層下深層區(qū)域，進行高速、大范圍三維成像的難題。傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡受限于點掃描方式，成像速度慢且光毒性高；而傳統(tǒng)單光子光片顯微鏡則難以穿透深層組織。2P-LSM則兼具了雙光子激發(fā)的深層穿透、光學層析能力和光片照明的高速、低光毒性優(yōu)勢。

02關(guān)鍵光學技術(shù)與成像過程
雙光子激發(fā)（2PE）原理應(yīng)用：系統(tǒng)利用近紅外飛秒脈沖激光作為激發(fā)光源。雙光子激發(fā)過程要求熒光分子同時吸收兩個長波長（低能量）光子，達到激發(fā)態(tài)。

這帶來了顯著優(yōu)勢：激發(fā)光波長更長（通常在~1000-1300nm范圍），散射更少，穿透深度顯著增加；激發(fā)只發(fā)生在物鏡焦平面附近一個極小的體積內(nèi)（光學層析），有效抑制了背景噪聲，提升了成像信噪比（SNR）和對比度；同時，長波長光子能量較低，對生物樣本的光損傷和光漂白效應(yīng)大大降低。

光片照明（Light-sheetillumination）實現(xiàn)：與傳統(tǒng)的點掃描2PE顯微鏡不同，本研究創(chuàng)新性地將激發(fā)光整形為一片薄而寬的光片。這片光片被側(cè)向投射到樣本中，僅照亮需要成像的焦平面。照明方式從點掃描變?yōu)槊嬲彰�，這是實現(xiàn)高速成像的關(guān)鍵。

高速三維成像流程：
光片生成與投射：近紅外飛秒激光經(jīng)過光束整形光學元件（如柱面鏡組）形成薄光片。
樣本照明：該光片從側(cè)面入射，照亮樣本內(nèi)部一個特定的焦平面（XY平面）。
熒光信號收集：位于照明光路垂直方向的另一套高數(shù)值孔徑（NA）物鏡收集被光片激發(fā)的樣本自發(fā)熒光或標記熒光信號。
面探測：收集的熒光信號被傳輸?shù)礁咚�、高靈敏度的相機（如sCMOS相機）進行探測。相機一次曝光即可獲取整個照明焦平面（一個光學切片）的圖像，速度遠快于點掃描。
三維層析：通過精密地沿Z軸（深度方向）移動樣本或物鏡，使光片依次照亮相鄰的不同焦平面。對每個焦平面進行高速面探測成像，最終將這些二維切片圖像組合起來，即可重構(gòu)出樣本的三維結(jié)構(gòu)。
動態(tài)觀測：快速重復(fù)上述三維成像過程，即可實現(xiàn)對活體樣本內(nèi)動態(tài)過程（如血流、鈣信號）的高速三維電影拍攝。

實驗結(jié)論明確：雙光子光片顯微鏡（2P-LSM）是一種強大的活體三維成像工具，它成功結(jié)合了雙光子激發(fā)的深層穿透、光學層析能力和光片照明的高速、低光毒性優(yōu)勢，首次實現(xiàn)了在活體哺乳動物大腦皮層下深層區(qū)域進行高速（Hz級體積速率）、大范圍（百微米級體積）、高分辨率（亞細胞水平）的三維動態(tài)成像，為神經(jīng)科學和生物醫(yī)學研究開辟了新視野。

創(chuàng)新與亮點
01突破核心難題
本研究的首要亮點在于成功突破了活體深組織高速三維動態(tài)成像的長期瓶頸。在活體組織中，尤其是哺乳動物大腦內(nèi)部，強烈的光散射嚴重限制了光學成像的深度和分辨率；高速成像需求與低光毒性以避免損傷活體樣本之間存在矛盾；傳統(tǒng)點掃描方式速度慢，難以捕捉快速生理過程。2P-LSM通過融合雙光子激發(fā)和光片照明，巧妙地解決了這一系列相互制約的難題：近紅外雙光子激發(fā)穿透更深、背景更低；光片照明實現(xiàn)高速面探測；兩者結(jié)合顯著降低了單位像素的光劑量，減輕了光損傷。

04廣泛的應(yīng)用價值
這項技術(shù)的價值遠不止于神經(jīng)科學。它為解決生物醫(yī)學研究中需要在活體、深層組織內(nèi)進行高速、高分辨率三維觀測的難題提供了通用平臺：
神經(jīng)科學：深入研究皮層下核團（如丘腦、下丘腦、基底節(jié)）在感覺處理、運動控制、睡眠覺醒、情緒記憶等高級功能中的作用，解析深部神經(jīng)回路動態(tài)。
血管生物學：在體定量研究深層微循環(huán)的血流動力學、血管調(diào)節(jié)、血管新生以及血腦屏障功能。
免疫學：實時觀察免疫細胞（如小膠質(zhì)細胞、外周浸潤免疫細胞）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)深層區(qū)域的巡邏、激活和相互作用。
腫瘤研究：監(jiān)測深層腫瘤微環(huán)境中的血管生成、免疫細胞浸潤、腫瘤細胞遷移和藥物輸送過程。
發(fā)育生物學：追蹤胚胎或器官發(fā)育過程中深層組織的細胞行為和組織形態(tài)發(fā)生。

總結(jié)與展望
本研究成功開發(fā)并驗證了雙光子光片顯微鏡（2P-LSM），這一創(chuàng)新技術(shù)將雙光子激發(fā)的深層穿透、光學層析能力與光片照明的高速、低光毒性優(yōu)勢完美融合，首次實現(xiàn)了在活體哺乳動物大腦皮層下深層區(qū)域（>600μm）進行高速（Hz級體積速率）、大范圍（百微米級體積）、高分辨率（亞細胞水平）的三維動態(tài)成像。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)成像方法在深度、速度和光損傷方面的限制，為清晰揭示活體深部組織（如丘腦、下丘腦）中神經(jīng)元活動、血管網(wǎng)絡(luò)動態(tài)和免疫細胞行為等關(guān)鍵生理過程提供了前所未有的強大工具，極大地推動了神經(jīng)科學、血管生物學及相關(guān)疾病研究的進展。

展望未來，該技術(shù)仍有優(yōu)化空間，例如通過自適應(yīng)光學進一步校正組織像差以提升更深層的成像質(zhì)量，開發(fā)多色甚至多光子版本以同時觀測更多生物指標，結(jié)合行為學裝置研究自由活動動物，以及探索在其它器官（如心臟、腎臟、腫瘤）深部成像的應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷成熟和應(yīng)用范圍的拓展，雙光子光片顯微鏡有望成為生命科學和生物醫(yī)學研究中不可或缺的利器，持續(xù)為理解復(fù)雜生命系統(tǒng)的動態(tài)奧秘提供關(guān)鍵洞察。

DOI:10.1038/s41598-025-07819-4.