CML199通過丁酸介導(dǎo)的腸骨軸促進(jìn)骨骼發(fā)育并改善衰老引起的骨質(zhì)丟失

文獻(xiàn)信息
中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉丹/咼于明團(tuán)隊(duì)的研究成果“Anaerostipes caccae CML199 enhances bone development and counteracts aging-induced bone loss through the butyrate-driven gut–bone axis: the chicken model”（糞厭氧棒桿菌CML199通過丁酸介導(dǎo)的腸-骨軸促進(jìn)骨骼發(fā)育并減緩衰老引起的骨質(zhì)流失：雞模型）在學(xué)術(shù)期刊《Microbiome》（IF：13.8）上發(fā)表。本研究首次鑒定并報(bào)導(dǎo)了禽類的髓質(zhì)骨結(jié)構(gòu)特征和發(fā)育規(guī)律，平生公司的離活一體CT（NEMO）在論文中提供了重要的圖像和定量分析結(jié)果。

該論文的通訊作者為劉丹副教授和咼于明教授，第一作者為呂正天老師。

文獻(xiàn)摘要
背景：腸道微生物是骨代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究腸道微生物群與骨重塑之間的關(guān)系為治療骨骼相關(guān)的疾病提供了新的途徑。盡管在理解哺乳動(dòng)物腸道微生物調(diào)控骨代謝方面取得了重大進(jìn)展，但有關(guān)鳥類的研究仍然有限。鳥類具有獨(dú)特的骨生理和解剖特征用以支持產(chǎn)卵。然而，腸道微生物是否以及如何影響鳥類的骨生理尚不清楚。在這項(xiàng)研究中，作者利用蛋雞作為研究模型首次鑒定并報(bào)導(dǎo)了鳥類特有的髓質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，解析了鳥類的骨骼發(fā)育模式，闡明了骨骼發(fā)育與腸道微生物之間的關(guān)系，并挖掘了一株具有骨調(diào)節(jié)作用的益生菌糞厭氧棒桿菌CML199。

結(jié)果：衰老導(dǎo)致蛋雞股骨骨密度持續(xù)增加。老年蛋雞骨髓腔內(nèi)髓質(zhì)骨的持續(xù)沉積導(dǎo)致骨小梁顯著減少、骨代謝減弱。盲腸微生物組成在性成熟前后發(fā)生了顯著變化，梭菌目中的一些菌屬可能與產(chǎn)蛋母雞的出生后骨骼發(fā)育有關(guān)。研究進(jìn)一步通過無菌雞模型和雞原代成骨細(xì)胞評(píng)估并鑒定出了一種具有骨代謝調(diào)節(jié)作用的益生菌株糞厭氧棒桿菌CML199（Anaerostipes caccae CML199，ANA）。其益生作用與發(fā)酵產(chǎn)物中的丁酸有關(guān)。長(zhǎng)達(dá)72周的長(zhǎng)期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，日糧添加ANA菌粉可以通過改善蛋雞的骨髓免疫微環(huán)境進(jìn)而促進(jìn)蛋雞性成熟時(shí)期的骨骼發(fā)育。在日糧中持續(xù)添加ANA菌粉50周可防止髓質(zhì)骨過度沉積，同時(shí)減輕衰老引起的骨質(zhì)疏松。

結(jié)論：這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了ANA對(duì)骨生理的益生作用，為家禽骨相關(guān)疾病的微生物干預(yù)提供了新的視角，并可能擴(kuò)展到人類健康。

實(shí)驗(yàn)方法
生長(zhǎng)發(fā)育期蛋雞日糧中添加ANA菌粉和包被丁酸鈉對(duì)蛋雞骨骼發(fā)育的影響
選取450只1日齡的京粉6號(hào)蛋雞，分為三個(gè)處理：飼喂基礎(chǔ)日糧的對(duì)照組（Control）、基礎(chǔ)日糧添加109 CFU/kg ANA凍干菌粉處理組（ANA組）和基礎(chǔ)日糧添加1.5 g/kg包被丁酸鈉處理組（CSB組），每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞。在試驗(yàn)的兩周內(nèi)，ANA組的蛋雞每隔一天接受108 CFU/mL ANA活菌灌喂（1 mL/只/天），對(duì)照組和CSB組的蛋雞接受等量生理鹽水灌喂，試驗(yàn)持續(xù)20周。

持續(xù)補(bǔ)充ANA對(duì)老齡蛋雞骨生理的影響
在20至72周之間，將ANA組的蛋雞按照體重平均分為兩組，其中一組繼續(xù)飼喂ANA菌粉（cANA組），另一組停止飼喂ANA菌粉，更換為基礎(chǔ)日糧（sANA），每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞。從對(duì)照組中隨機(jī)挑選60只雞，分為5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞，日糧不變，試驗(yàn)持續(xù)至72周齡。

Micro-CT分析
使用Micro-CT（NEMO，平生醫(yī)療科技有限公司）掃描蛋雞的股骨。為了確保后續(xù)分析的位置的一致性，股骨的最外側(cè)被選作標(biāo)志點(diǎn)，如圖所示。對(duì)于股骨微結(jié)構(gòu)掃描的區(qū)域，從藍(lán)色標(biāo)記區(qū)域下方的3 mm開始，分析共計(jì)60個(gè)切片（3 mm）。三維圖像采用1024 × 1024分辨率進(jìn)行可視化，圖像分割采用自適應(yīng)迭代閾值方法來區(qū)分皮質(zhì)骨、骨小梁和髓質(zhì)骨。

                                    圖1 股骨掃描區(qū)域界定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
蛋雞骨骼發(fā)育規(guī)律
依據(jù)結(jié)構(gòu)差異鑒定出了皮質(zhì)骨和骨小梁，依據(jù)CT值差異，鑒定出髓質(zhì)骨。髓質(zhì)骨在10周齡之前尚未發(fā)育形成，25周齡之后形成并隨蛋雞衰老逐漸填充骨髓腔。

性成熟之前（10-25周齡）是皮質(zhì)骨迅速發(fā)育的階段。與10周齡相比，25周齡蛋雞的Cb. BV顯著增加，直到98周齡保持穩(wěn)定；72周齡蛋雞的Cb. Th最高，其余周齡之間無顯著差異；Cb. BMD隨著蛋雞周齡增加不斷提高，25和45周齡蛋雞的Cb. BMD顯著高于10周齡，直至72周齡到達(dá)最高；Cb. BMC的變化趨勢(shì)與Cb. BV相同，25周齡顯著增加，并穩(wěn)定至98周齡。

衰老會(huì)導(dǎo)致骨小梁結(jié)構(gòu)損失，Tb. BV/TV在10-45周齡之間逐漸降低，45-98周齡之間變化不明顯。Tb. Th隨年齡增加不斷下降，在98周齡時(shí)降至最低。Tb. BS/TV變化趨勢(shì)與Tb. BV/TV類似，自生長(zhǎng)發(fā)育期至產(chǎn)蛋高峰期之后不斷地下降，并穩(wěn)定至98周齡。自10-72周齡，Tb. BMC出現(xiàn)陡降，在72和98周齡降至最低。Tb. BMD在10-45周齡期間保持穩(wěn)定，在45-98周齡之間不斷上升。Tb. BV和Tb. BS的變化趨勢(shì)相同，10-25周齡之間無顯著差異，25-45周齡期間顯著降低，并穩(wěn)定至98周齡。Tb. Sp在10-25周齡期間顯著增加，直至98周齡保持穩(wěn)定。Tb. N和Conn. D的變化趨勢(shì)恰好與Tb. Sp相反。Tb. Pf是衡量骨小梁連接度的一個(gè)指標(biāo)，發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)骨小梁模式因子增加，即骨小梁從板狀變?yōu)闂U狀，72-98周齡蛋雞的骨小梁模式因子顯著高于10、25和45周齡。蛋雞周齡的增加也伴隨著BM. CV/TV不斷縮小，在72周齡和98周齡時(shí)BM. CV/TV最小。

髓質(zhì)骨在25周齡之前尚未發(fā)育形成，進(jìn)入產(chǎn)蛋高峰期之后，Mb. BV/TV隨蛋雞周齡增加不斷提高，在72-98周齡期間達(dá)到最高。自25-98周齡之間，Mb. BMD不斷增加，98周齡時(shí)最高。Mb. BMC同樣在98周齡最高，其余周齡之間無顯著差異。與25周齡蛋雞相比，45周齡和72周齡的Mb. Th顯著增加，98周齡蛋雞的Mb. Th最高。髓質(zhì)骨的存在形式有兩種，在產(chǎn)蛋高峰期體積較小，彌散在骨小梁周圍，隨著周齡增加，體積逐漸增加，并逐漸形成球狀，甚至填充骨髓腔）。由此造成的結(jié)果是增加整體股骨的硬度。

圖2 蛋雞股骨與年齡相關(guān)的生理變化。通過CT掃描得到的皮質(zhì)骨（Cb）、骨小梁（Tb）和髓質(zhì)骨（Mb）的代表性圖像。B-E皮質(zhì)骨體積（Cb.BV）（B）、皮質(zhì)骨厚度（Cb.Th）（C）、皮質(zhì)骨骨密度（Cb.BMD）（D）和皮質(zhì)骨礦物質(zhì)含量（Cb.BMC）（E）的量化。F-J骨小梁體積（BV）與股骨總體積比（Tb.BV/總體積[TV]）的量化（F），骨小梁厚度（Tb.Th）（G），骨小梁表面積（BS）與股骨總量比（Tb.BS/TV）（H），骨小梁礦物質(zhì)含量（Tb.BMC）（I）和骨小梁骨密度（Tb.BMD）（J）。K髓腔體積與股骨總體積比的量化（BM.CV/TV）。L-N髓質(zhì)骨體積與股骨總體積比（Mb.BV/TV）（L）、髓質(zhì)骨骨密度（Mb.BMD）（M）和髓質(zhì)骨礦物質(zhì)含量（Mb.BMC）（N）的量化。 (O)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（FGF23）的mRNA表達(dá)。(P)股骨堿性磷酸酶（ALP）活性的測(cè)定。(Q)股骨中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性的測(cè)量。

Anaerostipes caccae CML199對(duì)育成期蛋雞骨骼發(fā)育的作用

為了評(píng)估ANA或丁酸鹽對(duì)蛋雞性成熟期骨骼發(fā)育的影響，從1日齡到20周齡，在蛋雞日糧中添加ANA凍干菌粉或包被丁酸鈉（CSB）。日糧中補(bǔ)充ANA菌粉末顯著增強(qiáng)了Cb.BV、Cb.Th和Cb.BMC。在骨小梁參數(shù)方面，補(bǔ)充ANA可改善Tb.BV/TV，Tb.BV，Tb.BMD和Tb.Th。補(bǔ)充CSB顯著增加了Tb.BV/TV，Tb.BS/TV和Tb.BS。盡管ANA補(bǔ)充對(duì)髓質(zhì)骨形成沒有明顯影響，但CSB補(bǔ)充增強(qiáng)了Mb.BV/TV。ANA和CSB處理均未表現(xiàn)出對(duì)Mb. BMC或Mb. BMD的調(diào)節(jié)作用。ANA和CSB均顯著提高了股骨ALP活性和血清OCN水平。ANA或CSB均未改變股骨TRAP活性，而補(bǔ)充CSB導(dǎo)致CTX-I水平降低。

圖6 日糧添加ANA菌粉和包被丁酸鈉可促進(jìn)性成熟期間的骨骼發(fā)育。對(duì)照組、ANA組和CSB組股骨皮質(zhì)骨（Cb）、小梁骨（Tb）和髓質(zhì)骨（Mb）的CT掃描圖像。B-E皮質(zhì)骨體積（Cb.BV）（B）、皮質(zhì)骨厚度（Cb.Th）（C）、皮質(zhì)骨礦物質(zhì)含量（Cb.BMC）（D）和皮質(zhì)骨密度（Cb.Th）（E）F-J骨小梁體積占比（Tb.BV/TV）（F）、骨小梁面積占比（Tb.BS/TV）（G）、骨小梁骨密度（Tb.BMD）（H）、骨小梁礦物質(zhì)含量（Tb.BMC）（I）和骨小梁厚度（Tb.Th）（J）的量化。K-M髓質(zhì)骨BV/TV（Mb.BV/TV）（K）、髓質(zhì)骨礦物質(zhì)含量（Mb.BMC）（L）和髓質(zhì)骨密度（Mb.BMD）（M）的量化。N-Q股骨堿性磷酸酶（ALP）活性（N）、血清骨鈣素（OCN）（O）、股骨抗酒石酸磷酸酶（TRAP）活性（P）和血清C-末端端肽-I（CTX-I）（Q）的測(cè)量。

Anaerostipes caccae CML199菌粉持續(xù)飼喂對(duì)老齡蛋雞骨骼的作用

cANA和sANA均輕微地提高了Cb. Th并顯著地降低了Cb. BMD。cANA對(duì)骨小梁有明顯的保護(hù)作用，表現(xiàn)為Tb. BV，Tb. BV/TV，Tb. Th均顯著高于對(duì)照組。sANA組的各個(gè)骨參數(shù)水平介于cANA和對(duì)照組之間。cANA組的Mb. BV/TV明顯少于對(duì)照組，Mb. BMD輕微降低。在對(duì)照組內(nèi)，髓質(zhì)骨開始明顯地轉(zhuǎn)變?yōu)榍驙罨蛲耆�填充骨髓腔。cANA組蛋雞的股骨ALP和TRAP活性，血清OCN水平均顯著高于對(duì)照組，sANA僅略微增加了股骨ALP活性。

圖8 持續(xù)補(bǔ)充ANA菌粉可以防止衰老引起的骨質(zhì)流失。對(duì)照組、cANA組（持續(xù)補(bǔ)充ANA菌粉）和sANA組（停止補(bǔ)充ANA菌粉）股骨皮質(zhì)骨（Cb）、骨小梁（Tb）和髓質(zhì)骨（Mb）的代表性圖像。B-E皮質(zhì)骨體積（Cb.BV）（B）、皮質(zhì)骨厚度（Cb.Th）（C）、皮質(zhì)骨骨密度（Cb.BMD）（D）和皮質(zhì)骨礦物質(zhì)含量（Cb.BMC）（E）的量化。F-J骨小梁BV/TV（Tb.BV/TV）的定量（F）、骨小梁BS/TV（Tb.BS/TV）（G）、骨小梁骨密度（Tb.BMD）（H）、骨小梁礦物質(zhì)含量（Tb.BMC）（I）和骨小梁厚度（Tb.Th）（J）。K-M髓質(zhì)骨BV/TV（K）、髓質(zhì)骨密度（Mb.BMD）（L）和髓質(zhì)骨礦物質(zhì)含量（Mb.BMC）（M）的量化。N-Q股骨堿性磷酸酶（ALP）活性（N）、血清骨鈣素（OCN）（O）、股骨抗酒石酸磷酸酶（TRAP）活性（P）和血清C-末端端肽-I（CTX-I）（Q）的測(cè)量。

使用結(jié)論
本研究闡明了蛋雞獨(dú)特的骨骼發(fā)育模式，并鑒定了一種具有骨調(diào)節(jié)作用的新型益生菌株。作者的研究結(jié)果表明，隨著蛋雞周齡的增長(zhǎng)，骨髓腔內(nèi)髓質(zhì)骨的持續(xù)沉積會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的骨小梁損失。盲腸菌群結(jié)構(gòu)在性成熟前后發(fā)生了顯著變化，梭菌屬內(nèi)的一些屬可能與蛋雞的骨骼發(fā)育有關(guān)。ANA通過其發(fā)酵產(chǎn)物中的丁酸鹽促進(jìn)骨形成。ANA通過改善蛋雞骨髓的免疫微環(huán)境來促進(jìn)性成熟期間的骨發(fā)育。持續(xù)50周的ANA飲食補(bǔ)充可防止髓質(zhì)骨過度沉積，減輕衰老引起的骨小梁損失。這項(xiàng)研究為家禽骨相關(guān)疾病的微生物干預(yù)提供了新的視角，并可能擴(kuò)展到人類健康。

使用設(shè)備

  Micro CT (型號(hào)：NEMO) (平生醫(yī)療科技)
影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）