抗CD47抗體的抗腫瘤活性依賴于與Fc-FcγR的相互作用
背景介紹
CD47廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，通過與巨噬細(xì)胞上的抑制性受體SIRPα結(jié)合，傳遞“別吃我”信號，幫助腫瘤逃避先天免疫攻擊�？笴D47抗體通過阻斷“別吃我”信號(CD47-SIRPα)來促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞，是近年來免疫治療的熱點。然而，早期臨床試驗顯示，抗CD47抗體單藥治療在多種腫瘤中療效有限，表明僅阻斷CD47-SIRPα結(jié)合不足以實現(xiàn)高效的腫瘤抑制，因此產(chǎn)生的一個問題是，這些抗體的抗腫瘤活性除了依賴于與Fab區(qū)域的結(jié)合，是否也與Fc-Fcγ受體結(jié)合密切相關(guān)。但關(guān)于Fc段的集合作用機(jī)制目前仍未達(dá)成共識。
針對該問題，2023年11月，Juan C. Osorio 等人在Cancer cell發(fā)表題為“The Antitumor Activities of Anti-CD47 Antibodies Require Fc-FcγR interactions”的研究論文。研究通過構(gòu)建人源化CD47、SIRPα及FcγRs的小鼠模型，克服了傳統(tǒng)模型無法準(zhǔn)確模擬人源相互作用的局限，系統(tǒng)揭示了Fc-FcγR相互作用是抗CD47抗體發(fā)揮最佳抗腫瘤活性的必要條件，并闡明了其通過重塑腫瘤微環(huán)境來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)制，在此基礎(chǔ)上探索了Fc優(yōu)化策略以提升其治療指數(shù)。
該研究中，抗CD47抗體的可變區(qū)序列由BSI DeepAB抗體測序服務(wù)通過高精度質(zhì)譜法完成從頭測序，所得序列信息隨后用于Fc修飾抗體的設(shè)計。BSI DeepAB測序服務(wù)方案采用多酶消化結(jié)合高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，借助PEAKS AB軟件進(jìn)行深度序列覆蓋分析，并通過將自下而上組裝的序列理論質(zhì)量與完整蛋白質(zhì)量測量值進(jìn)行比對完成序列驗證。此外，該服務(wù)還涵蓋亮氨酸/異亮氨酸區(qū)分、翻譯后修飾(PTM)及糖型分析等內(nèi)容。這一套完整的測序服務(wù)流程能夠高效實現(xiàn)抗體序列的高精度從頭解析與全面表征，為本研究的Fc工程改造提供了關(guān)鍵的序列起點。
研究方法
該研究通過抗體Fc工程構(gòu)建不同F(xiàn)cγR親和力的抗CD47變體，并結(jié)合FcRγ鏈敲除小鼠模型，證明激活型FcγR結(jié)合是療效的必要條件；利用流式細(xì)胞術(shù)與細(xì)胞耗竭實驗明確巨噬細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞是關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，并證實Fc優(yōu)化抗體可清除Treg、誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答及免疫記憶；
為跨越種屬差異，采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建hCD47/hSIRPα/hFcγR三基因人源化小鼠及相應(yīng)人源化腫瘤細(xì)胞系，實現(xiàn)臨床抗體的真實評估；在此基礎(chǔ)上，通過系統(tǒng)性vs局部給藥對比及血常規(guī)監(jiān)測，揭示Fc優(yōu)化抗體雖療效增強(qiáng)但系統(tǒng)毒性增加，而瘤內(nèi)注射可在保持療效、誘導(dǎo)遠(yuǎn)隔效應(yīng)的同時顯著減輕貧血與血小板減少。
研究結(jié)果
01. 激活型FcγR受體的參與是抗CD47抗體發(fā)揮最佳抗腫瘤活性的必要條件
Figure 1.激活FcγR的參與增強(qiáng)了阻斷mCD47的抗體在體內(nèi)的抗腫瘤活性
02. Fc優(yōu)化抗CD47抗體通過重塑腫瘤微環(huán)境、增加巨噬細(xì)胞浸潤與吞噬活性發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)
在確認(rèn)Fc-Fcγ受體軸的必要性后，研究進(jìn)一步剖析腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞動態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化分析顯示，MIAP301-mIgG2a處理后腫瘤內(nèi)CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，并向腫瘤核心區(qū)浸潤；而中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等無明顯變化。
表型分析顯示，巨噬細(xì)胞表面MHCII、CD80、CD86表達(dá)下調(diào)，但免疫抑制標(biāo)志物CD206、CD163、PD-L1未見上調(diào)，提示其處于活化后狀態(tài)而非抑制性表型。
為進(jìn)一步明確效應(yīng)細(xì)胞類型，研究者分別耗竭巨噬細(xì)胞和CCR2+單核細(xì)胞，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞耗竭完全消除MIAP301-mIgG2a的抗腫瘤活性，而單核細(xì)胞耗竭無此效果，證明巨噬細(xì)胞是該抗體療效所必需的效應(yīng)細(xì)胞。
體外吞噬實驗進(jìn)一步證實，MIAP301-mIgG2a可顯著增強(qiáng)骨髓源巨噬細(xì)胞對多種腫瘤細(xì)胞的吞噬能力，且該效應(yīng)伴隨MHCII、CD80、CD86下調(diào)，與體內(nèi)表型一致。由此得出結(jié)論：抗CD47抗體通過Fc段結(jié)合激活型FcγR，直接增加腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞數(shù)量并增強(qiáng)其吞噬活性，巨噬細(xì)胞是該治療策略的核心效應(yīng)細(xì)胞。
Figure 2. 經(jīng)Fc優(yōu)化增強(qiáng)激活型FcγR結(jié)合的抗mCD47抗體與腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞數(shù)量增加及吞噬活性增強(qiáng)相關(guān)
03. Fc優(yōu)化抗CD47抗體清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、激活CD8+T細(xì)胞并誘導(dǎo)長期免疫記憶
研究同時發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面CD47表達(dá)水平顯著高于CD4+或CD8+ T細(xì)胞，這一特征使其成為Fc優(yōu)化抗體的優(yōu)先清除靶點。MIAP301-mIgG2a處理后，瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及絕對數(shù)量均顯著下降，證實該清除效應(yīng)是Fc介導(dǎo)的。
通過抗CD8抗體體內(nèi)耗竭CD8+T細(xì)胞后，MIAP301-mIgG2a的療效同樣消失，證明適應(yīng)性免疫應(yīng)答不可或缺。
調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少的同時，CD8+ T細(xì)胞的顆粒酶B產(chǎn)生及抗原特異性T細(xì)胞比例顯著升高，且未見耗竭標(biāo)志物上調(diào)。CD8+ T細(xì)胞耗竭后抗體療效完全消失，證明CD8+ T細(xì)胞是該治療策略的必要效應(yīng)細(xì)胞。
更為重要的是，經(jīng)MIAP301-mIgG2a治療達(dá)到完全緩解的小鼠，在首次腫瘤接種后90天以5倍劑量再次接種相同腫瘤細(xì)胞時，仍可完全排斥腫瘤，而初治小鼠則迅速成瘤。
由此得出結(jié)論：Fc優(yōu)化抗CD47抗體通過Fc段結(jié)合激活型FcγR，可選擇性清除高表達(dá)CD47的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，解除免疫抑制，進(jìn)而激活腫瘤特異性CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答，并最終形成長期、系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫記憶。
Figure 3. FC優(yōu)化的抗mCD47抗體可減少Tregs并促進(jìn)抗原特異性CD8+T細(xì)胞的浸潤
04. 人源化CD47/SIRPα/Fcγ受體三基因敲入小鼠模型的建立為臨床抗體評估提供高置信度體內(nèi)平臺
在明確了小鼠系統(tǒng)中mFcγR參與對抗CD47抗體活性的貢獻(xiàn)后，研究進(jìn)一步探討該發(fā)現(xiàn)是否同樣適用于靶向人CD47的抗體。研究團(tuán)隊采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將小鼠內(nèi)源性CD47與SIRPα的胞外域分別替換為相應(yīng)人源序列，成功構(gòu)建hCD47/hSIRPα雙基因敲入小鼠；并與實驗室前期建立的人源化Fcγ受體小鼠雜交，獲得hCD47/hSIRPα/hFcγR三基因人源化小鼠。與此同時，研究團(tuán)隊采用相同策略構(gòu)建了表達(dá)人CD47的MC38及B16腫瘤細(xì)胞系，實現(xiàn)了在人源化免疫背景下的同基因移植。
基于這一平臺，研究者將臨床候選抗體5F9改造為三種不同小鼠Fc亞型的嵌合抗體，并在皮下瘤及肺轉(zhuǎn)移模型中系統(tǒng)比較其抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，只有能夠高效結(jié)合激活型小鼠FcγR的mIgG2a變體在體內(nèi)表現(xiàn)出顯著抑瘤效果，且在體外吞噬實驗中也具備最強(qiáng)活性。
上述結(jié)果驗證了該研究在免疫健全小鼠系統(tǒng)中得出的初步結(jié)論，證明“激活型FcγR參與是療效必要條件“這一機(jī)制同樣適用于抗人CD47抗體。
Figure 4. hCD47/hSIRPα KI小鼠的表征及經(jīng)Fc優(yōu)化增強(qiáng)激活型FcγR結(jié)合的阻斷型與非阻斷型抗hCD47抗體的抗腫瘤活性
05. Fc優(yōu)化型抗人CD47抗體療效增強(qiáng)伴隨系統(tǒng)性毒性增加，瘤內(nèi)注射可實現(xiàn)療效與毒性解耦
基于上述人源化平臺，研究對比了臨床在研的Fc弱結(jié)合型抗體5F9-hIgG4與Fc優(yōu)化型變體5F9-GAALIE的系統(tǒng)性給藥效應(yīng)。結(jié)果顯示，5F9-GAALIE在MC38-hCD47及B16-hCD47人源化腫瘤模型中均表現(xiàn)出顯著更強(qiáng)的抑瘤活性；然而，系統(tǒng)性腹腔注射該抗體誘發(fā)了劑量依賴性的貧血與血小板減少，且毒性強(qiáng)度與Fc激活能力呈正相關(guān),5F9-GAALIE在2.5 mg/kg劑量即導(dǎo)致顯著血細(xì)胞下降，而5F9-hIgG4在10 mg/kg劑量下方出現(xiàn)類似改變，高劑量下5F9-GAALIE組小鼠出現(xiàn)死亡。這一毒性譜系精準(zhǔn)重現(xiàn)了臨床抗CD47抗體治療中“靶向腫瘤外毒性”的瓶頸。
值得注意的是，將給藥方式由腹腔注射改為瘤內(nèi)局部注射后，5F9-GAALIE在2.5 mg/kg劑量下仍可有效抑制注射側(cè)腫瘤生長，并在雙側(cè)腫瘤模型中誘導(dǎo)顯著的遠(yuǎn)隔效應(yīng)，同時外周紅細(xì)胞與血小板計數(shù)維持在正常范圍。這一發(fā)現(xiàn)為Fc優(yōu)化抗體的臨床轉(zhuǎn)化提供了可行的風(fēng)險控制路徑：局部給藥可在保留Fc優(yōu)化療效增益的同時，有效規(guī)避系統(tǒng)性靶向毒性。
此外，在抗PD-1單藥耐藥的B16-hCD47黑色素瘤模型中，5F9-GAALIE單藥治療即顯著有效，且與系統(tǒng)性PD-1阻斷聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。由此得出結(jié)論：局部給藥可在保留Fc優(yōu)化療效增益及遠(yuǎn)隔免疫效應(yīng)的同時，有效規(guī)避系統(tǒng)性靶向毒性。這一策略為Fc優(yōu)化型抗CD47抗體的臨床轉(zhuǎn)化提供了可行的風(fēng)險控制路徑。
Figure 5. CD47Sirpα和FcγR的人源化小鼠模型復(fù)現(xiàn)了全人源抗CD47抗體的活性和毒性特征
Figure 6. Fc優(yōu)化型人源化抗CD47抗體促進(jìn)有效的體內(nèi)抗腫瘤活性
06. 有效的體內(nèi)抗腫瘤活性需要同時具備CD47/SIRPα軸阻斷與激活型FcγR信號參與
利用已建立的人源化CD47抗體評估系統(tǒng)，研究進(jìn)一步探究：究竟是激活型FcγR的參與本身足以驅(qū)動抗腫瘤活性，還是必須同時實現(xiàn)CD47/SIRPα信號的阻斷？
為解決這一問題，研究設(shè)置了對照實驗：將阻斷型抗人CD47抗體5F9與非阻斷型抗人CD47抗體2D3統(tǒng)一改造為相同的小鼠IgG2a Fc骨架，確保二者Fc段對激活型Fcγ受體的招募能力完全對等，從而單獨評估Fab段功能差異對療效的影響。
體內(nèi)藥效結(jié)果顯示，5F9-mIgG2a在B16-hCD47肺轉(zhuǎn)移模型中顯著降低腫瘤負(fù)荷，而2D3-mIgG2a完全無效。這一對比最終閉合了邏輯鏈條：抗CD47抗體欲實現(xiàn)最佳抗腫瘤活性，必須同時滿足兩個條件:Fab段有效阻斷CD47-SIRPα以解除“別吃我”信號，F(xiàn)c段有效招募激活型Fcγ受體以啟動“來吃我”信號。二者缺一不可，單有其一均不足以驅(qū)動顯著療效。
結(jié)論與意義
該研究系統(tǒng)探討了抗CD47抗體的Fc結(jié)構(gòu)域在多個種屬匹配模型中對體內(nèi)最佳抗腫瘤活性的必要貢獻(xiàn)，為理解此類新興治療性抗體的作用機(jī)制提供了新的視角。利用人源化CD47-SIRPα及FcγRs的三基因敲入小鼠模型，研究證實：經(jīng)Fc工程改造、增強(qiáng)與激活型FcγR結(jié)合的抗CD47抗體，可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞及抗原特異性T細(xì)胞向腫瘤內(nèi)浸潤，同時有效耗竭調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而重塑腫瘤微環(huán)境、激活長效抗腫瘤免疫。然而，系統(tǒng)給藥時Fc優(yōu)化亦導(dǎo)致劑量依賴性靶向性腫瘤外毒性。值得注意的是，采用局部瘤內(nèi)注射可在保留上述療效增益及遠(yuǎn)隔效應(yīng)的同時，將靶向性腫瘤外毒性降至最低。該研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了Fc優(yōu)化在開發(fā)高效抗CD47療法中的核心地位，并為增強(qiáng)這一前景廣闊的免疫治療策略的臨床療效提供了可行的風(fēng)險控制路徑。
原文鏈接：https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S1535-6108%2823%2900363-X
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CD47廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，通過與巨噬細(xì)胞上的抑制性受體SIRPα結(jié)合，傳遞“別吃我”信號，幫助腫瘤逃避先天免疫攻擊�？笴D47抗體通過阻斷“別吃我”信號(CD47-SIRPα)來促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞，是近年來免疫治療的熱點。然而，早期臨床試驗顯示，抗CD47抗體單藥治療在多種腫瘤中療效有限，表明僅阻斷CD47-SIRPα結(jié)合不足以實現(xiàn)高效的腫瘤抑制，因此產(chǎn)生的一個問題是，這些抗體的抗腫瘤活性除了依賴于與Fab區(qū)域的結(jié)合，是否也與Fc-Fcγ受體結(jié)合密切相關(guān)。但關(guān)于Fc段的集合作用機(jī)制目前仍未達(dá)成共識。
針對該問題，2023年11月，Juan C. Osorio 等人在Cancer cell發(fā)表題為“The Antitumor Activities of Anti-CD47 Antibodies Require Fc-FcγR interactions”的研究論文。研究通過構(gòu)建人源化CD47、SIRPα及FcγRs的小鼠模型，克服了傳統(tǒng)模型無法準(zhǔn)確模擬人源相互作用的局限，系統(tǒng)揭示了Fc-FcγR相互作用是抗CD47抗體發(fā)揮最佳抗腫瘤活性的必要條件，并闡明了其通過重塑腫瘤微環(huán)境來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)制，在此基礎(chǔ)上探索了Fc優(yōu)化策略以提升其治療指數(shù)。
該研究中，抗CD47抗體的可變區(qū)序列由BSI DeepAB抗體測序服務(wù)通過高精度質(zhì)譜法完成從頭測序，所得序列信息隨后用于Fc修飾抗體的設(shè)計。BSI DeepAB測序服務(wù)方案采用多酶消化結(jié)合高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，借助PEAKS AB軟件進(jìn)行深度序列覆蓋分析，并通過將自下而上組裝的序列理論質(zhì)量與完整蛋白質(zhì)量測量值進(jìn)行比對完成序列驗證。此外，該服務(wù)還涵蓋亮氨酸/異亮氨酸區(qū)分、翻譯后修飾(PTM)及糖型分析等內(nèi)容。這一套完整的測序服務(wù)流程能夠高效實現(xiàn)抗體序列的高精度從頭解析與全面表征，為本研究的Fc工程改造提供了關(guān)鍵的序列起點。
研究方法
該研究通過抗體Fc工程構(gòu)建不同F(xiàn)cγR親和力的抗CD47變體，并結(jié)合FcRγ鏈敲除小鼠模型，證明激活型FcγR結(jié)合是療效的必要條件；利用流式細(xì)胞術(shù)與細(xì)胞耗竭實驗明確巨噬細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞是關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，并證實Fc優(yōu)化抗體可清除Treg、誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答及免疫記憶；
為跨越種屬差異，采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建hCD47/hSIRPα/hFcγR三基因人源化小鼠及相應(yīng)人源化腫瘤細(xì)胞系，實現(xiàn)臨床抗體的真實評估；在此基礎(chǔ)上，通過系統(tǒng)性vs局部給藥對比及血常規(guī)監(jiān)測，揭示Fc優(yōu)化抗體雖療效增強(qiáng)但系統(tǒng)毒性增加，而瘤內(nèi)注射可在保持療效、誘導(dǎo)遠(yuǎn)隔效應(yīng)的同時顯著減輕貧血與血小板減少。
研究結(jié)果
01. 激活型FcγR受體的參與是抗CD47抗體發(fā)揮最佳抗腫瘤活性的必要條件
為明確Fc段在抗CD47抗體療效中的真實貢獻(xiàn)，研究者通過對抗小鼠CD47抗體MIAP301進(jìn)行Fc工程改造，獲得對小鼠FcγRs具有不同親和力的三種Fc亞型變體，并在免疫健全小鼠模型中系統(tǒng)比較其抗腫瘤活性。實驗證明，只有能夠高效結(jié)合激活型FcγRs的mIgG2a變體在皮下瘤及肺轉(zhuǎn)移模型中均表現(xiàn)出顯著抑瘤效果，而無FcγR結(jié)合能力的D265A變體及激活型FcγR信號缺失的小鼠中，該療效均消失。此外，在聯(lián)合抗gp75抗體或抗PD-1抗體的治療策略中，mIgG2a變體同樣展現(xiàn)出最優(yōu)協(xié)同效應(yīng)。由此得出結(jié)論：抗CD47抗體必須通過Fc段有效招募激活型FcγRs，方能發(fā)揮最佳體內(nèi)抗腫瘤活性，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)Fc優(yōu)化策略提供了關(guān)鍵理論依據(jù)。
Figure 1.激活FcγR的參與增強(qiáng)了阻斷mCD47的抗體在體內(nèi)的抗腫瘤活性
02. Fc優(yōu)化抗CD47抗體通過重塑腫瘤微環(huán)境、增加巨噬細(xì)胞浸潤與吞噬活性發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)
在確認(rèn)Fc-Fcγ受體軸的必要性后，研究進(jìn)一步剖析腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞動態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化分析顯示，MIAP301-mIgG2a處理后腫瘤內(nèi)CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，并向腫瘤核心區(qū)浸潤；而中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等無明顯變化。
表型分析顯示，巨噬細(xì)胞表面MHCII、CD80、CD86表達(dá)下調(diào)，但免疫抑制標(biāo)志物CD206、CD163、PD-L1未見上調(diào)，提示其處于活化后狀態(tài)而非抑制性表型。
為進(jìn)一步明確效應(yīng)細(xì)胞類型，研究者分別耗竭巨噬細(xì)胞和CCR2+單核細(xì)胞，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞耗竭完全消除MIAP301-mIgG2a的抗腫瘤活性，而單核細(xì)胞耗竭無此效果，證明巨噬細(xì)胞是該抗體療效所必需的效應(yīng)細(xì)胞。
體外吞噬實驗進(jìn)一步證實，MIAP301-mIgG2a可顯著增強(qiáng)骨髓源巨噬細(xì)胞對多種腫瘤細(xì)胞的吞噬能力，且該效應(yīng)伴隨MHCII、CD80、CD86下調(diào)，與體內(nèi)表型一致。由此得出結(jié)論：抗CD47抗體通過Fc段結(jié)合激活型FcγR，直接增加腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞數(shù)量并增強(qiáng)其吞噬活性，巨噬細(xì)胞是該治療策略的核心效應(yīng)細(xì)胞。
Figure 2. 經(jīng)Fc優(yōu)化增強(qiáng)激活型FcγR結(jié)合的抗mCD47抗體與腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞數(shù)量增加及吞噬活性增強(qiáng)相關(guān)
03. Fc優(yōu)化抗CD47抗體清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、激活CD8+T細(xì)胞并誘導(dǎo)長期免疫記憶
研究同時發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面CD47表達(dá)水平顯著高于CD4+或CD8+ T細(xì)胞，這一特征使其成為Fc優(yōu)化抗體的優(yōu)先清除靶點。MIAP301-mIgG2a處理后，瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及絕對數(shù)量均顯著下降，證實該清除效應(yīng)是Fc介導(dǎo)的。
通過抗CD8抗體體內(nèi)耗竭CD8+T細(xì)胞后，MIAP301-mIgG2a的療效同樣消失，證明適應(yīng)性免疫應(yīng)答不可或缺。
調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少的同時，CD8+ T細(xì)胞的顆粒酶B產(chǎn)生及抗原特異性T細(xì)胞比例顯著升高，且未見耗竭標(biāo)志物上調(diào)。CD8+ T細(xì)胞耗竭后抗體療效完全消失，證明CD8+ T細(xì)胞是該治療策略的必要效應(yīng)細(xì)胞。
更為重要的是，經(jīng)MIAP301-mIgG2a治療達(dá)到完全緩解的小鼠，在首次腫瘤接種后90天以5倍劑量再次接種相同腫瘤細(xì)胞時，仍可完全排斥腫瘤，而初治小鼠則迅速成瘤。
由此得出結(jié)論：Fc優(yōu)化抗CD47抗體通過Fc段結(jié)合激活型FcγR，可選擇性清除高表達(dá)CD47的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，解除免疫抑制，進(jìn)而激活腫瘤特異性CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答，并最終形成長期、系統(tǒng)性的抗腫瘤免疫記憶。
Figure 3. FC優(yōu)化的抗mCD47抗體可減少Tregs并促進(jìn)抗原特異性CD8+T細(xì)胞的浸潤
04. 人源化CD47/SIRPα/Fcγ受體三基因敲入小鼠模型的建立為臨床抗體評估提供高置信度體內(nèi)平臺
在明確了小鼠系統(tǒng)中mFcγR參與對抗CD47抗體活性的貢獻(xiàn)后，研究進(jìn)一步探討該發(fā)現(xiàn)是否同樣適用于靶向人CD47的抗體。研究團(tuán)隊采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，將小鼠內(nèi)源性CD47與SIRPα的胞外域分別替換為相應(yīng)人源序列，成功構(gòu)建hCD47/hSIRPα雙基因敲入小鼠；并與實驗室前期建立的人源化Fcγ受體小鼠雜交，獲得hCD47/hSIRPα/hFcγR三基因人源化小鼠。與此同時，研究團(tuán)隊采用相同策略構(gòu)建了表達(dá)人CD47的MC38及B16腫瘤細(xì)胞系，實現(xiàn)了在人源化免疫背景下的同基因移植。
基于這一平臺，研究者將臨床候選抗體5F9改造為三種不同小鼠Fc亞型的嵌合抗體，并在皮下瘤及肺轉(zhuǎn)移模型中系統(tǒng)比較其抗腫瘤活性。結(jié)果顯示，只有能夠高效結(jié)合激活型小鼠FcγR的mIgG2a變體在體內(nèi)表現(xiàn)出顯著抑瘤效果，且在體外吞噬實驗中也具備最強(qiáng)活性。
上述結(jié)果驗證了該研究在免疫健全小鼠系統(tǒng)中得出的初步結(jié)論，證明“激活型FcγR參與是療效必要條件“這一機(jī)制同樣適用于抗人CD47抗體。
Figure 4. hCD47/hSIRPα KI小鼠的表征及經(jīng)Fc優(yōu)化增強(qiáng)激活型FcγR結(jié)合的阻斷型與非阻斷型抗hCD47抗體的抗腫瘤活性
05. Fc優(yōu)化型抗人CD47抗體療效增強(qiáng)伴隨系統(tǒng)性毒性增加，瘤內(nèi)注射可實現(xiàn)療效與毒性解耦
基于上述人源化平臺，研究對比了臨床在研的Fc弱結(jié)合型抗體5F9-hIgG4與Fc優(yōu)化型變體5F9-GAALIE的系統(tǒng)性給藥效應(yīng)。結(jié)果顯示，5F9-GAALIE在MC38-hCD47及B16-hCD47人源化腫瘤模型中均表現(xiàn)出顯著更強(qiáng)的抑瘤活性；然而，系統(tǒng)性腹腔注射該抗體誘發(fā)了劑量依賴性的貧血與血小板減少，且毒性強(qiáng)度與Fc激活能力呈正相關(guān),5F9-GAALIE在2.5 mg/kg劑量即導(dǎo)致顯著血細(xì)胞下降，而5F9-hIgG4在10 mg/kg劑量下方出現(xiàn)類似改變，高劑量下5F9-GAALIE組小鼠出現(xiàn)死亡。這一毒性譜系精準(zhǔn)重現(xiàn)了臨床抗CD47抗體治療中“靶向腫瘤外毒性”的瓶頸。
值得注意的是，將給藥方式由腹腔注射改為瘤內(nèi)局部注射后，5F9-GAALIE在2.5 mg/kg劑量下仍可有效抑制注射側(cè)腫瘤生長，并在雙側(cè)腫瘤模型中誘導(dǎo)顯著的遠(yuǎn)隔效應(yīng)，同時外周紅細(xì)胞與血小板計數(shù)維持在正常范圍。這一發(fā)現(xiàn)為Fc優(yōu)化抗體的臨床轉(zhuǎn)化提供了可行的風(fēng)險控制路徑：局部給藥可在保留Fc優(yōu)化療效增益的同時，有效規(guī)避系統(tǒng)性靶向毒性。
此外，在抗PD-1單藥耐藥的B16-hCD47黑色素瘤模型中，5F9-GAALIE單藥治療即顯著有效，且與系統(tǒng)性PD-1阻斷聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。由此得出結(jié)論：局部給藥可在保留Fc優(yōu)化療效增益及遠(yuǎn)隔免疫效應(yīng)的同時，有效規(guī)避系統(tǒng)性靶向毒性。這一策略為Fc優(yōu)化型抗CD47抗體的臨床轉(zhuǎn)化提供了可行的風(fēng)險控制路徑。
Figure 5. CD47Sirpα和FcγR的人源化小鼠模型復(fù)現(xiàn)了全人源抗CD47抗體的活性和毒性特征
Figure 6. Fc優(yōu)化型人源化抗CD47抗體促進(jìn)有效的體內(nèi)抗腫瘤活性
06. 有效的體內(nèi)抗腫瘤活性需要同時具備CD47/SIRPα軸阻斷與激活型FcγR信號參與
利用已建立的人源化CD47抗體評估系統(tǒng)，研究進(jìn)一步探究：究竟是激活型FcγR的參與本身足以驅(qū)動抗腫瘤活性，還是必須同時實現(xiàn)CD47/SIRPα信號的阻斷？
為解決這一問題，研究設(shè)置了對照實驗：將阻斷型抗人CD47抗體5F9與非阻斷型抗人CD47抗體2D3統(tǒng)一改造為相同的小鼠IgG2a Fc骨架，確保二者Fc段對激活型Fcγ受體的招募能力完全對等，從而單獨評估Fab段功能差異對療效的影響。
體內(nèi)藥效結(jié)果顯示，5F9-mIgG2a在B16-hCD47肺轉(zhuǎn)移模型中顯著降低腫瘤負(fù)荷，而2D3-mIgG2a完全無效。這一對比最終閉合了邏輯鏈條：抗CD47抗體欲實現(xiàn)最佳抗腫瘤活性，必須同時滿足兩個條件:Fab段有效阻斷CD47-SIRPα以解除“別吃我”信號，F(xiàn)c段有效招募激活型Fcγ受體以啟動“來吃我”信號。二者缺一不可，單有其一均不足以驅(qū)動顯著療效。
結(jié)論與意義
該研究系統(tǒng)探討了抗CD47抗體的Fc結(jié)構(gòu)域在多個種屬匹配模型中對體內(nèi)最佳抗腫瘤活性的必要貢獻(xiàn)，為理解此類新興治療性抗體的作用機(jī)制提供了新的視角。利用人源化CD47-SIRPα及FcγRs的三基因敲入小鼠模型，研究證實：經(jīng)Fc工程改造、增強(qiáng)與激活型FcγR結(jié)合的抗CD47抗體，可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞及抗原特異性T細(xì)胞向腫瘤內(nèi)浸潤，同時有效耗竭調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而重塑腫瘤微環(huán)境、激活長效抗腫瘤免疫。然而，系統(tǒng)給藥時Fc優(yōu)化亦導(dǎo)致劑量依賴性靶向性腫瘤外毒性。值得注意的是，采用局部瘤內(nèi)注射可在保留上述療效增益及遠(yuǎn)隔效應(yīng)的同時，將靶向性腫瘤外毒性降至最低。該研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了Fc優(yōu)化在開發(fā)高效抗CD47療法中的核心地位，并為增強(qiáng)這一前景廣闊的免疫治療策略的臨床療效提供了可行的風(fēng)險控制路徑。
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