NIR-II納米顆粒高分辨率體內(nèi)成像：從全身血管可視化到病理微環(huán)境監(jiān)測(cè)

本文要點(diǎn)：為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)疾病診斷，高發(fā)光效率的熒光探針至關(guān)重要。為克服近紅外二區(qū)（NIR-II）有機(jī)染料長(zhǎng)期存在的量子產(chǎn)率低的局限，本文巧妙地設(shè)計(jì)了一種聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）發(fā)光體TPE-Hexoxyl。通過(guò)協(xié)同抑制π-π堆積并最小化分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，構(gòu)建出NIR-II納米顆粒，其亮度位居已報(bào)道有機(jī)探針之列（絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率ΦPL = 0.9%）。體外研究表明，TPE-Hexoxyl納米顆粒具有優(yōu)異的膠體穩(wěn)定性與顯著的光穩(wěn)定性。活體成像顯示其具備高空間分辨率與長(zhǎng)效組織滯留能力，可實(shí)現(xiàn)對(duì)全身血管系統(tǒng)、腦微血管網(wǎng)絡(luò)及淋巴系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)高對(duì)比度可視化。尤為突出的是，TPE-Hexoxyl納米顆粒在原位4T1荷瘤小鼠模型中對(duì)腫瘤病灶的檢測(cè)靈敏度顯著提升，并能精確繪制炎癥性腸病模型中炎癥區(qū)域的空間分布，凸顯其在臨床病理診斷中的變革性潛力。本研究確立了一種用于設(shè)計(jì)高亮度有機(jī)NIR-II熒光團(tuán)的分子調(diào)控范式，為后續(xù)臨床診斷應(yīng)用提供了先進(jìn)的分子工具。

方案1. 制備及體內(nèi)應(yīng)用NIR-II AIE NPs（TPE-Hexoxyl NPs）用于生物影像

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在本研究中，通過(guò)引入三苯胺（TPA）和四苯乙烯（TPE）作為分子轉(zhuǎn)子、3,4-雙（2-乙基己氧基）噻吩作為π橋以及苯并[1,2-c:4,5-c]雙[1,2,5]噻二唑（BBTD）作為電子受體，合理設(shè)計(jì)了兩種新型D−π−A−π−D型近紅外二區(qū)（NIR-II）聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）探針TPA-Hexoxyl和TPE-Hexoxyl。值得注意的是，選擇3,4-雙（2-乙基己氧基）噻吩作為π橋至關(guān)重要，因?yàn)槠鋬蓚�(gè)2-乙基己氧基鏈顯著增加了分子的空間位阻。這種增加有效地減少了所得熒光團(tuán)中的π-π堆積，從而提高了聚集態(tài)下的ΦPL。與基于TPA的同類探針相比，TPE部分顯著減弱了扭曲內(nèi)旋轉(zhuǎn)（TICT）效應(yīng)，從而大幅提高了ΦPL。經(jīng)兩親性聚合物包覆后，TPE-Hexoxyl納米顆粒（NPs）-1在極性水溶液中表現(xiàn)出極高的相對(duì)ΦPL，高達(dá)3.67%（以IR-26為參照，ΦPL=0.05%），絕對(duì)ΦPL為0.9%，凸顯了其在生物成像應(yīng)用中的卓越潛力。TPE-Hexoxyl NPs的卓越亮度使其能夠?qū)ι畈拷M織（包括全身血管系統(tǒng)、腦血管系統(tǒng)和淋巴網(wǎng)絡(luò)（淋巴結(jié)/血管））進(jìn)行高分辨率成像。此外，該探針在精確映射4T1原位腫瘤和炎癥性腸病模型方面表現(xiàn)出色（方案1），為超靈敏體內(nèi)疾病診斷建立了一套多功能工具。

圖1. TPA-Hexoxyl和B)TPE-Hexoxyl的分子結(jié)構(gòu)及表征

TPA-Hexoxyl和TPE-Hexoxyl化合物以TPA和TPE作為分子轉(zhuǎn)子和電子供體合成（圖1A,B）。兩種化合物均具有典型的D−π−A−π−D結(jié)構(gòu)，其中BBTD作為強(qiáng)電子受體。

為闡明其電子性質(zhì)，進(jìn)行了密度泛函理論（DFT）計(jì)算。優(yōu)化后的基態(tài)（S₀）幾何結(jié)構(gòu)顯示，最高占據(jù)分子軌道（HOMOs）主要定域于噻吩π橋和BBTD核心，而最低未占據(jù)分子軌道（LUMOs）則集中于BBTD核心（圖1C）。盡管TPE單元的電子供體能力弱于TPA，導(dǎo)致TPE-Hexoxyl的HOMO-LUMO能隙（1.61 eV）略大于TPA-Hexoxyl（1.33 eV），但減弱的D−A相互作用有效緩解了TICT效應(yīng)，從而保證了較高的量子產(chǎn)率。如圖1D所示，TPE-Hexoxyl在S₀與激發(fā)態(tài)（S₁）之間存在顯著結(jié)構(gòu)差異，均方根偏差（RMSD）為11.2 Å，表明光激發(fā)后發(fā)生明顯幾何變化。這種大偏差由激發(fā)誘導(dǎo)的電子重排驅(qū)動(dòng)，導(dǎo)致顯著的結(jié)構(gòu)弛豫，涉及鍵長(zhǎng)、鍵角及整體構(gòu)象的大幅位移。

光物理表征表明，兩種化合物在500–850 nm范圍內(nèi)具有強(qiáng)吸收，并在900–1200 nm區(qū)域表現(xiàn)出強(qiáng)熒光發(fā)射，凸顯其在NIR-II成像中的潛力（圖1E）。此外，TPE-Hexoxyl在聚集態(tài)下展現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的NIR-II熒光，表明非輻射衰減被有效抑制。在THF/水混合溶液中的聚集行為顯示，盡管兩種化合物在THF中熒光微弱，但隨著水含量增加，其發(fā)射顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)出典型的聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）特征（圖1F）。為評(píng)估其TICT效應(yīng)，研究了兩種分子在不同溶劑中的光譜特性。值得注意的是，TPE-Hexoxyl的發(fā)射強(qiáng)度下降程度低于TPA-Hexoxyl，表明其TICT效應(yīng)弱于TPA-Hexoxyl。

為提升其在生物成像中的適用性，采用生物相容性兩親性聚合物DSPE-mPEG2K作為載體，通過(guò)納米沉淀法制備了水分散性納米顆粒（NPs）。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）與透射電子顯微鏡（TEM）分析表明，TPE-Hexoxyl NPs與TPA-Hexoxyl NPs均呈球形膠束結(jié)構(gòu)，流體動(dòng)力學(xué)直徑分別為72 nm和98 nm（圖1G），在水溶液中Zeta電位分別為−20 mV和−21 mV（圖1H）。如圖1I所示，兩類納米顆粒的熒光強(qiáng)度較其單分子溶液顯著增強(qiáng)，凸顯其聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）特性。

隨后，對(duì)其熒光發(fā)射特性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估。盡管在808 nm激發(fā)下，TPE-Hexoxyl NPs的摩爾消光系數(shù)（ɛ = 4400 M⁻¹ cm⁻¹）低于TPA-Hexoxyl NPs（ɛ = 10700 M⁻¹ cm⁻¹），但以IR-26（在1,2-二氯乙烷中ΦPL = 0.05%）為參照時(shí)，TPE-Hexoxyl NPs的相對(duì)熒光量子產(chǎn)率（ΦPL = 2.53%）顯著高于TPA-Hexoxyl NPs（ΦPL = 0.69%）（圖1J）。為直觀評(píng)估其光學(xué)性能，計(jì)算了定義為ɛ × ΦPL的熒光亮度。定量分析顯示，在808 nm激光激發(fā)下，TPE-Hexoxyl NPs的亮度值達(dá)1.11 m⁻¹ cm⁻¹，較TPA-Hexoxyl NPs（0.74 m⁻¹ cm⁻¹）提升約50%（圖1K），這一提升對(duì)高信背比（SBR）成像至關(guān)重要。此外，當(dāng)采用更剛性的聚苯乙烯（PS）-PEG5K作為載體時(shí)，TPE-Hexoxyl在水溶液中的ΦPL進(jìn)一步提升至3.67%（圖1J）。鑒于TPE-Hexoxyl NPs卓越的ΦPL，進(jìn)一步測(cè)定其絕對(duì)量子產(chǎn)率，結(jié)果達(dá)0.9%。此外，TPE-Hexoxyl NPs在PBS緩沖液及10%胎牛血清（FBS）中連續(xù)7天保持穩(wěn)定的粒徑分布。與吲哚菁綠（ICG）相比，該納米顆粒在0.8 W/cm²功率密度的808 nm激光照射20分鐘后表現(xiàn)出極低的光漂白（圖1L），表明其具備優(yōu)異的光穩(wěn)定性和膠體穩(wěn)定性，適用于長(zhǎng)期活體成像。

圖2. 體外近紅外二區(qū)熒光成像、組織穿透深度及生物相容性評(píng)估

TPE-Hexoxyl NPs在不同濃度下的NIR-II熒光強(qiáng)度（偽青色）通過(guò)小動(dòng)物成像系統(tǒng)捕獲。圖像顯示熒光強(qiáng)度隨濃度增加而增強(qiáng)，可在寬濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)成像應(yīng)用。在不同長(zhǎng)通（LP）濾波器（1000−1250 nm）下亦觀察到明亮發(fā)射，但波長(zhǎng)越高，強(qiáng)度越低（圖2A）。為定量評(píng)估組織穿透能力，使用808 nm激光激發(fā)體外組織模擬仿體（雞胸組織），并采用優(yōu)化的NIR-II成像參數(shù)（1000 nm LP濾波器、8000 mA電流、200 ms曝光時(shí)間）。如圖2B、C所示，TPE-Hexoxyl NPs的熒光強(qiáng)度隨組織厚度呈指數(shù)衰減，在50 mm穿透深度時(shí)接近背景水平。這種增強(qiáng)的組織穿透能力源于納米顆粒的高ΦPL與NIR-II光譜窗口固有的生物光子學(xué)優(yōu)勢(shì)之間的協(xié)同作用，即散射系數(shù)降低和自體熒光抑制。

在開(kāi)展體內(nèi)研究前，系統(tǒng)評(píng)估了TPE-Hexoxyl NPs的生物安全性，包括其在808 nm激光照射（57.9 mW cm⁻²，5 min）下的光熱性能。光熱實(shí)驗(yàn)表明，即使?jié)舛雀哌_(dá)200 µM，TPE-Hexoxyl NPs僅引起溫和的溫度升高（ΔT ≈ 3 °C），表明其光熱加熱效應(yīng)可忽略不計(jì)。在此基礎(chǔ)上，使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3）和小鼠成纖維細(xì)胞（L929）進(jìn)行的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，在濃度高達(dá)100 µM時(shí)，未觀察到顯著細(xì)胞毒性（細(xì)胞存活率 > 95%）或?qū)�這些正常細(xì)胞增殖的抑制作用（p > 0.05）（圖2D）。這些結(jié)果證實(shí)了TPE-Hexoxyl NPs優(yōu)異的生物相容性。

溶血實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了其卓越的血液相容性：在100 µM濃度下，溶血率為1.20% ± 0.04%（圖2E），顯著低于ISO 10993–4國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的5%安全閾值。通過(guò)尾靜脈注射對(duì)正常小鼠進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估顯示，給藥后1小時(shí)內(nèi)血漿濃度迅速下降（圖2F），歸因于納米顆�？焖俚娜�身分布能力，有效減少了局部組織蓄積引起的系統(tǒng)毒性并縮短了代謝周期。這一快速分布特性為高亮度AIEgen的體內(nèi)生物成像提供了顯著優(yōu)勢(shì)�；�于模型計(jì)算的關(guān)鍵藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：消除半衰期（t₁/₂）為45.922 h，平均滯留時(shí)間MRT(0-t)為11.511 ± 1.331 h，藥物暴露量AUC(0-t)為6841.188 ± 582.429 mg·L⁻¹·h⁻¹。

圖3. 血管網(wǎng)絡(luò)和淋巴結(jié)的體內(nèi)近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像

在TPE-Hexoxyl NPs表現(xiàn)出良好生物相容性及優(yōu)異的體外NIR-II成像潛力的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步評(píng)估了其在健康小鼠中的血管成像與淋巴結(jié)可視化性能。納米顆粒通過(guò)尾靜脈注射給藥（200 µL，1 mM濃度）。為更清晰地揭示微血管成像趨勢(shì)，開(kāi)展了平行實(shí)驗(yàn)（N = 7）。成像采用配備1000、1100、1200、1300、1400和1500 nm長(zhǎng)通（LP）濾波器的InGaAs相機(jī)，記錄腹側(cè)與背側(cè)方向的血管造影特征（圖3A）。成像結(jié)果清晰展現(xiàn)了全身血管網(wǎng)絡(luò)，后肢微血管及動(dòng)靜脈間組織結(jié)構(gòu)在穿透皮膚與組織層后仍可明確分辨，凸顯了高熒光強(qiáng)度對(duì)成像質(zhì)量的關(guān)鍵作用。隨著LP濾波器波長(zhǎng)增加，血管信號(hào)顯著性與成像效能逐步提升。定量統(tǒng)計(jì)分析表明，后肢血管（以白色虛線標(biāo)示）在1400 nm波長(zhǎng)下成像性能最優(yōu)，其平均半高寬（FWHM）最�。�0.479 ± 0.029 mm），平均信背比（SBR）最高（10.649 ±1.935）（圖3B、C）。該組間極小變異證實(shí)了成像結(jié)果的高度平行性。耳部毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)同樣在1400 nm下獲得最優(yōu)FWHM與SBR指標(biāo)（圖3D）。頭皮剝離后對(duì)腦微血管的進(jìn)一步觀察顯示，使用1400 nm濾波器可清晰呈現(xiàn)小腦血管結(jié)構(gòu)，包括表淺靜脈、上矢狀竇與橫竇（圖3E）。足墊注射后5分鐘內(nèi)，納米顆粒在內(nèi)側(cè)腘淋巴結(jié)與坐骨淋巴結(jié)區(qū)域顯著富集（圖3F）。關(guān)鍵的ICG共示蹤實(shí)驗(yàn)表明，納米顆粒與經(jīng)典淋巴示蹤劑在淋巴管、腘淋巴結(jié)及坐骨淋巴結(jié)中的分布模式近乎一致，證實(shí)了其強(qiáng)大的淋巴結(jié)靶向能力。綜上，這些結(jié)果充分驗(yàn)證了TPE-Hexoxyl NPs在體內(nèi)NIR-II熒光成像中的應(yīng)用潛力。

圖4. TPE-Hexoxyl納米顆粒在原位乳腺癌小鼠模型中的體內(nèi)近紅外二區(qū)熒光成像

腫瘤成像在癌癥診療一體化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，增強(qiáng)滲透與滯留（EPR）效應(yīng)使納米顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤特異性富集，從而支持精準(zhǔn)診斷。 在全面評(píng)估TPE-Hexoxyl NPs在健康小鼠全身血管網(wǎng)絡(luò)與淋巴結(jié)的NIR-II熒光成像性能后，本文進(jìn)一步構(gòu)建了原位4T1乳腺癌模型，以評(píng)價(jià)其體內(nèi)腫瘤靶向能力。如圖4A所示，通過(guò)NIR-II熒光成像系統(tǒng)（激發(fā)波長(zhǎng)：808 nm，發(fā)射濾光片：1000 nm LP，電流值：3000 mA）進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，揭示了靜脈注射納米顆粒在腫瘤部位的時(shí)間依賴性富集特征。定量分析（圖4B）表明，腫瘤熒光強(qiáng)度在48 h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降；值得注意的是，強(qiáng)熒光信號(hào)可持續(xù)至192 h，僅較峰值強(qiáng)度降低37.28%，從而證實(shí)TPE-Hexoxyl NPs具有卓越的腫瘤靶向能力與長(zhǎng)效滯留特性。為明確生物分布特征，于注射后192 h處死小鼠進(jìn)行離體分析。切除腫瘤及主要器官的熒光成像（圖4C）結(jié)合半定量區(qū)域興趣評(píng)估（圖4D）顯示，納米顆粒在腫瘤組織、肝臟和脾臟中呈現(xiàn)顯著富集。該分布模式在機(jī)制上與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）介導(dǎo)的納米顆粒截留及腫瘤特異性EPR效應(yīng)的協(xié)同作用一致。至關(guān)重要的是，對(duì)腫瘤組織及主要器官（心、肝、脾、肺、腎）的H&E染色切片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，未觀察到炎癥浸潤(rùn)、細(xì)胞空泡化或壞死等病理改變，組織結(jié)構(gòu)完整，進(jìn)一步佐證了該納米平臺(tái)良好的生物相容性。

圖5. 炎癥性腸病小鼠模型中TPE-Hexoxyl納米顆粒的體內(nèi)近紅外二區(qū)熒光成像

TPE-Hexoxyl在乳腺癌NIR-II成像中展現(xiàn)出卓越病灶靶向能力的基礎(chǔ)上，接著利用右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的炎癥性腸�。↖BD）小鼠模型，探究該納米平臺(tái)在體內(nèi)的炎癥靶向特異性。如圖5A所示，BALB/c小鼠被隨機(jī)分為DSS誘導(dǎo)組（N = 4）和對(duì)照組（N = 4）。模型組小鼠連續(xù)8天自由飲用含3%（w/v）DSS的飲水，隨后改用普通飲水恢復(fù)4天，以模擬疾病進(jìn)展與緩解過(guò)程；對(duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均飲用普通飲水。每日監(jiān)測(cè)顯示，DSS處理組小鼠自第4天起出現(xiàn)進(jìn)行性體重下降，至第8天體重降至對(duì)照組的81.02%（p < 0.001），并伴有明顯血便（圖5B、C），證實(shí)IBD模型成功建立且具備典型臨床表型。所有小鼠于第10天經(jīng)尾靜脈注射200 µL、1 mM的TPE-Hexoxyl NPs。為精確解析信號(hào)空間分布，在處死后48 h進(jìn)行離體NIR-II熒光成像（1000 nm LP濾光片），并使用InGaAs相機(jī)系統(tǒng)對(duì)兩組小鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行系統(tǒng)性成像分析。

離體腸道NIR-II成像顯示，兩組小鼠的小腸段均未檢測(cè)到顯著熒光信號(hào)（圖5D）。特異性熒光信號(hào)主要定位于結(jié)腸壁組織，通過(guò)Image J軟件進(jìn)行定量分析證實(shí)，DSS處理組結(jié)腸的NIR-II信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（圖5E、F）。值得注意的是，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎導(dǎo)致結(jié)腸顯著縮短（7.0 ± 0.5 cm vs 8.9 ± 0.4 cm，p < 0.05，圖5F），這一宏觀指標(biāo)反映了炎癥性水腫、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及組織損傷的嚴(yán)重程度。從高熒光強(qiáng)度區(qū)域精確采集的結(jié)腸組織切片進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果：DSS處理組結(jié)腸呈現(xiàn)典型炎癥改變，包括密集的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、隱窩結(jié)構(gòu)紊亂及廣泛的上皮潰瘍，而對(duì)照組腸道組織結(jié)構(gòu)保持完整（圖5G）。這些發(fā)現(xiàn)共同確立了一種基于可視化精準(zhǔn)評(píng)估炎癥性腸病（IBD）的新型分子成像工具。

綜上所述，本文構(gòu)建了一種的高亮度NIR-II熒光探針TPE-Hexoxyl，具備聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）特性，通過(guò)引入3,4-雙(2-乙基己氧基)噻吩作為π橋并優(yōu)化電子供體基團(tuán)設(shè)計(jì)而成。通過(guò)涵蓋密度泛函理論（DFT）計(jì)算與實(shí)驗(yàn)分析的系統(tǒng)研究，揭示了TPE-Hexoxyl納米顆粒中π-π堆積的減弱與扭曲電荷轉(zhuǎn)移（TICT）效應(yīng)的抑制協(xié)同作用，使其在水溶液中具有異常高的量子產(chǎn)率（QY），成為目前已報(bào)道最明亮的NIR-II有機(jī)探針之一。得益于其在NIR-II窗口的高熒光強(qiáng)度，TPE-Hexoxyl納米顆�？蓪�(shí)現(xiàn)小鼠全身血管網(wǎng)絡(luò)及淋巴微結(jié)構(gòu)的高分辨率成像，具有高信背比（SBR）與窄半峰寬（FWHM）。此外，借助EPR介導(dǎo)的富集效應(yīng)，該納米探針可精準(zhǔn)勾勒腫瘤與炎癥微環(huán)境，展現(xiàn)出特異性靶向能力。所開(kāi)發(fā)的納米探針同時(shí)具備優(yōu)異的光穩(wěn)定性、生物相容性及長(zhǎng)效組織滯留特性，為推進(jìn)臨床早期診斷技術(shù)提供了全新視角。

 

 

參考文獻(xiàn)

Lin D, Huang W, Yang H, et al. Ultrabright NIR‐II Nanoparticles for High‐Resolution In Vivo Imaging: From Systemic Vasculature Visualization to Pathological Microenvironment Monitoring[J]. Advanced Materials, 2025: e10493.

 

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