熒光原位雜交(FISH)的原理、實驗流程和技術(shù)聯(lián)用

Section.01
熒光原位雜交
(FISH) 技術(shù)
 
熒光原位雜交 (簡稱 FISH)——一種重要的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，該技術(shù)用于獲取空間基因組和轉(zhuǎn)錄組信息。FISH 廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究，以及預(yù)防醫(yī)學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的診斷應(yīng)用。

它是檢測染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)！
 

基本原理

熒光原位雜交是一種用于檢測和定位染色體上特定 DNA 序列的實驗室技術(shù)。該技術(shù)將個體的全套染色體固定在載玻片上，然后用 "探針" (一小段標(biāo)記有熒光染料的純化 DNA)進(jìn)行染色。熒光標(biāo)記的探針會找到并結(jié)合染色體上的對應(yīng)序列。借助專用顯微鏡，可以觀察到熒光探針結(jié)合的染色體及其亞染色體區(qū)域。常用來確定結(jié)合了熒光探針的 DNA 區(qū)域、RNA 分子在染色體及其他細(xì)胞器中的定位 (圖 1)。

技術(shù)優(yōu)勢

- 高靈敏度與特異性：可精準(zhǔn)檢測并定位目標(biāo)核酸序列，即便處于復(fù)雜細(xì)胞環(huán)境中，也能有效區(qū)分目標(biāo)序列與非目標(biāo)序列。
- 支持多色熒光標(biāo)記：能夠同時檢測多個目標(biāo)序列，顯著提升檢測效率與準(zhǔn)確性。
- 直觀可視化效果：借助熒光顯微鏡，可直接觀察目標(biāo)序列在細(xì)胞或組織內(nèi)的分布及定位情況。
- 適用范圍廣泛：可應(yīng)用于分裂與非分裂細(xì)胞，能夠檢測隱性基因缺失、基因易位及低水平基因嵌合體，且可在石蠟包埋組織 (PET) 切片上進(jìn)行操作。

Section.02
實驗流程

FISH 實驗的核心步驟為：樣品制備 →預(yù)處理 →雜交 →洗滌  →復(fù)染與封片 →熒光顯微鏡觀察與分析。

其中，樣品預(yù)處理的關(guān)鍵在于暴露細(xì)胞或組織內(nèi)的核酸，以確保探針有效結(jié)合，這一過程通常涉及蛋白酶消化與梯度乙醇脫水操作。組織預(yù)處理步驟見圖 2。

組織預(yù)處理完成后，使用疏水屏障筆對載玻片上的組織進(jìn)行包膜處理 (圈畫)，隨后置于蛋白酶溶液中室溫孵育。洗滌后，將組織轉(zhuǎn)移至臺式培養(yǎng)箱雜交 2 小時，再依次進(jìn)行擴(kuò)增步驟。完成 FISH 探針處理后，組織需先進(jìn)行洗滌，再用正常馬血清封閉。一抗孵育在 4°C 條件下過夜進(jìn)行，以確�？贵w與抗原的充分結(jié)合；二抗孵育則在室溫下持續(xù) 2 小時 (圖 3)。

表1. FISH探針的主要類型。

Section.03
FISH 的技術(shù)聯(lián)用

mRNA FISH-IHC

mRNA FISH 和 IHC 成像結(jié)合可用于表征 AD 模型中補體靶向療法的療效，或結(jié)合其他與阿爾茨海默病病理相關(guān)的蛋白聚集體 (如 tau、突觸核蛋白) 研究基因表達(dá)。

『案例』：結(jié)合 FISH 和 IHC 檢測小鼠大腦中淀粉樣斑塊膠質(zhì)補體表達(dá)

補體蛋白可促進(jìn)阿爾茨海默病 (AD)的神經(jīng)退行性病變，這類蛋白由包圍 β- 淀粉樣斑塊的膠質(zhì)細(xì)胞分泌。為此，作者提出了一種基于酪酰胺-地高辛(Tyramide-digoxigenin) 信號擴(kuò)增技術(shù)的 Aβ 斑塊檢測優(yōu)化方案 (如圖 4)。該方案結(jié)合多重 mRNA 原位熒光雜交 (FISH) 技術(shù)，用于檢測 TauPS2APP 小鼠模型中 Aβ 斑塊近端區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞特異性的補體表達(dá)情況。結(jié)果表明，通過信號放大處理，在連續(xù)的 FISH-IHC 實驗中可獲得更高的信噪比，并實現(xiàn)對彌漫性 Aβ 斑塊的靈敏檢測 (如圖 5)。

FISH-Flow

FISH-Flow 技術(shù)通過將熒光寡核苷酸與 RNA 雜交，借助流式細(xì)胞術(shù)實現(xiàn)單細(xì)胞層面的熒光定量分析。

『案例』：FISH-Flow 用于定量小鼠和人類細(xì)胞中新生和成熟核糖體 RNA。

研究人員開發(fā)了一種 FISH-Flow 方法，可用于定量小鼠和人類細(xì)胞中新生的 47S rRNA 以及成熟的 18S 和 28S rRNA，該方法還能結(jié)合 DNA 染色技術(shù)，完成跨細(xì)胞周期階段的 rRNA 定量檢測 (如圖 6)。

無論是新生的還是成熟的核糖體 RNA 在細(xì)胞中都十分豐富。因此，如圖 7A 所示，針對 rRNA 的 FISH 探針具有較高的信噪比。用 DNA 結(jié)合的 DAPI 染料進(jìn)行染色，可將細(xì)胞群體分為 G1/S/G2-M 期，并對細(xì)胞周期各階段的 rRNA 進(jìn)行定量，如圖 7B 所示。

序列熒光原位雜交 (seqFISH)

序列熒光原位雜交 (seqFISH，sequential fluorescence in situ hybridization) 是一種先進(jìn)的生物分子分析方法，將成像技術(shù)與組合分子條形碼技術(shù)相結(jié)合，利用已知序列的探針，對細(xì)胞/組織內(nèi)的全 RNA 做多輪雜交成像，通過分析探針兩臂區(qū)域 barcode 的熒光信號組合來判斷基因 ID，講特定位置信息與基因 ID 關(guān)聯(lián)生成圖像。seqFISH 方法能夠在原生組織和器官環(huán)境中獲得高分辨率的細(xì)胞類型、狀態(tài)、和鄰域關(guān)系信息 (圖 8)。

圖 8. Stereo-seq 流程^[6]。

步驟 1，設(shè)計 DNB 模式化陣列芯片。步驟 2，原位測序以確定唯一條形碼寡核苷酸的空間坐標(biāo)。步驟 3，通過將含 UMI-polyT 的寡核苷酸連接到每個點來制備捕獲探針。步驟 4，從組織中進(jìn)行原位 RNA 捕獲。步驟 5，cDNA 擴(kuò)增、文庫構(gòu)建和測序。步驟 6，數(shù)據(jù)分析。
 
Section.04
諾獎得主的最新研究：
smLiveFISH

就在今年！諾貝爾化學(xué)獎得主、CRISPR 基因編輯技術(shù)先驅(qū) Jennifer Doudna 教授團(tuán)隊在Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為 “Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm” 的研究論文。該團(tuán)隊開發(fā)出一種單分子活細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù) (Single-molecule live-cell fluorescence in situ hybridization，smLiveFISH)。

smLiveFISH

【單分子活細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)】

該技術(shù)借助嗜熱鏈球菌來源的 RNA 靶向 III-A 型 CRISPR-Csm 系統(tǒng)及多重向?qū)�RNA，使研究人員能夠在包含原代細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型中，直接且高效地實現(xiàn)單個 RNA 分子的可視化，進(jìn)而追蹤不同種類活細(xì)胞中單個 mRNA 分子的動態(tài)軌跡 (圖 9)。

圖 9. smLiveFISH 系統(tǒng)的工作示意圖^[7]。

如圖所示，GFP 標(biāo)記的 Csm 復(fù)合物標(biāo)記單個 NOTCH2 mRNA (圖 10 a 和 b 左圖)，smFISH 探針標(biāo)記 NOTCH2 mRNA (圖 10 a 和 b 中圖)，兩者的疊加圖像顯示共定位情況 (圖 10 a 和 b 右圖)。Csm 復(fù)合物病灶與 smFISH 病灶的共定位比例、以及具有 Csm 復(fù)合物標(biāo)記病灶的轉(zhuǎn)染細(xì)胞比例均可進(jìn)行量化 (圖 10c-d)。

通過雙色成像驗證，Csm 復(fù)合物成功標(biāo)記內(nèi)源性 NOTCH2 mRNA，并在多種細(xì)胞類型中實現(xiàn)穩(wěn)健檢測，且未對 mRNA 的穩(wěn)定性、衰變速率、定位及蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)生影響。此外，smLiveFISH 技術(shù)也成功標(biāo)記 MAP1B mRNA，通過共定位實驗驗證了信號的準(zhǔn)確性，同時揭示其在細(xì)胞外圍富集的空間分布特征，且同樣未干擾 mRNA 的穩(wěn)定性、衰變速率、定位及蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)一步證明該技術(shù)適用于不同 RNA 分子的可視化研究。

MCE 可以根據(jù)客戶需求提供 FISH 探針的設(shè)計和定制服務(wù)，進(jìn)行相關(guān)的檢測服務(wù)(純度、序列和結(jié)構(gòu)分析等)，確保產(chǎn)品的有效性與一致性，始終保證優(yōu)質(zhì)高效的服務(wù)品質(zhì)！

 

產(chǎn)品推薦

Alexa fluor 488 azide ditriethylamine Alexa fluor 488 azide ditriethylamine 是一種多功能染料。

BODIPY-FL NHS ester BODIPY-FL NHS ester (BODIPY FL, SE) 是一種能透過細(xì)胞膜的胺反應(yīng)性熒光探針。

6-Fluorescein phosphoramidite 6-Fluorescein phosphoramidite 是一種有效的熒光染料。6-Fluorescein phosphoramidite 可用于標(biāo)記寡核苷酸。

Cy3 phosphoramidite Cy3 phosphoramidite 是一種用于標(biāo)記寡核苷酸的熒光染料。

Cy5 Phosphoramidite Cy5 Phosphoramidite 是一種熒光染料，可用于寡核苷酸的合成。

 

[1] Debnath, et al. Molecular Diagnostics: Promises and Possibilities.Springer.2010;153-170.
[2] Dereli AS, et al. Combining Multiplex Fluorescence in situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections. J Vis Exp. 2021 Jun 25;(172). 
[3]N.P.Pringle.etal.Insituhybridizationprotocols. https://www.ucl.ac.uk/%7Eucbzwdr/In%20Situ%20Protocol.pdf
[4] Rao S, et al. Protocol for detection of glial complement expression in relation to amyloid plaques in mouse brain with combined FISH and IHC. STAR Protoc. 2024 Dec 20;5(4):103388. 
[5] Antony C, et al. FISH-Flow to quantify nascent and mature ribosomal RNA in mouse and human cells. STAR Protoc. 2023 Sep 15;4(3):102463. 
[6] Chen A, et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 2022 May 12;185(10).
[7] Xia C, et al. Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR-Csm. Nat Biotechnol. 2025 Feb 18.