多光子顯微鏡（MPM）生物組織成像技術(shù)新進展
多光子顯微鏡（MPM）是一種強大的無標記生物組織成像技術(shù)，能夠通過非線性光學效應獲取多種對比度信息。本文介紹了一項創(chuàng)新研究，開發(fā)了一種緊湊型多模態(tài)成像系統(tǒng)，能夠同時實現(xiàn)雙光子顯微鏡（2PM）和三光子顯微鏡（3PM）的圖像采集。該系統(tǒng)采用雙激發(fā)波長（790 nm和1580 nm），在無需標記的情況下，同步獲取雙光子激發(fā)熒光（2PEF）、二次諧波生成（SHG）和三次諧波生成（THG）信號，從而提供細胞、膠原纖維和界面等結(jié)構(gòu)的互補信息。研究重點解決了雙波長同時激發(fā)時的信號分離挑戰(zhàn)，并提出了基于核的非線性縮放（KNS）去噪算法，以提升低信噪比圖像的質(zhì)量。通過生物樣品實驗，驗證了同時成像在減少運動偽影和熱損傷方面的優(yōu)勢，為無標記在體成像奠定了基礎(chǔ)。
本研究的核心貢獻由WENTAO WU、CHRISTOPH BRANDT、XIN ZHOU和SHUO TANG團隊完成，研究成果以題為“Label-free multimodal imaging with simultaneous two-photon and three-photon microscopy and kernel-based nonlinear scaling denoising”的論文形式，發(fā)表在光學領(lǐng)域權(quán)威期刊《Biomedical Optics Express》上。
重要發(fā)現(xiàn)
01系統(tǒng)設(shè)計與同時成像原理
研究團隊設(shè)計了一套基于光纖的緊湊型多模態(tài)MPM系統(tǒng)，其核心創(chuàng)新在于通過單一激光源（摻鉺光纖激光器）產(chǎn)生雙波長激發(fā)光。激光經(jīng)周期性極化鎂氧化物摻雜鈮酸鋰（PPLN）晶體倍頻后，輸出790 nm和1580 nm的飛秒脈沖，分別用于激發(fā)2PM和3PM信號。系統(tǒng)采用微型微機電系統(tǒng)（MEMS）鏡進行XY掃描，并結(jié)合形狀記憶合金驅(qū)動器實現(xiàn)軸向深度掃描，整體結(jié)構(gòu)小巧，潛在支持手持式成像頭開發(fā)。光學布局中，通過二向色分光鏡精確分離2PEF、SHG和THG信號，但由于2PEF和THG光譜部分重疊，檢測通道存在串擾，需通過后處理減法算法消除。
同時成像的優(yōu)勢顯著體現(xiàn)在速度提升和偽影抑制上。與順序采集（先2PM后3PM）相比，同步采集將成像時間減半，避免了樣本運動或機械漂移導致的空間錯位。實驗以小鼠股骨為例，順序采集時SHG和THG圖像因5分鐘延遲出現(xiàn)約6μm偏移，而同步采集基本消除該問題。此外，系統(tǒng)利用雙波長的焦距偏移（約80μm）分散激光能量，熱模擬顯示雙焦點成像比單焦點最高溫度降低約50%，減少了組織熱損傷風險。
02信號處理與去噪算法創(chuàng)新多模態(tài)成像的核心挑戰(zhàn)之一是各通道信號強度差異大，尤其是THG信號常比2PEF弱數(shù)個量級，導致合并圖像時噪聲凸顯。研究提出了一種基于核的非線性縮放（KNS）去噪方法，其原理是通過比較像素局部核區(qū)域與全局平均亮度，動態(tài)調(diào)整像素強度。具體而言，對圖像中每個像素生成n×n核（核尺寸根據(jù)組織特征大小設(shè)定，如20×20像素），利用經(jīng)驗公式計算縮放比，迭代應用以提升信噪比。與傳統(tǒng)方法（如高斯濾波、離群值去除）和自監(jiān)督深度學習算法Noise2Void（N2V）相比，KNS在超低信號圖像中表現(xiàn)優(yōu)異，信噪比提升可達10dB以上，且計算速度快（單圖像迭代約34毫秒），適合實時處理。
KNS的普適性通過多種生物樣本驗證，例如小鼠耳廓軟骨層的THG圖像（顯示軟骨細胞陷窩的蜂窩結(jié)構(gòu)）和紅楓葉片的SHG圖像（源于葉綠體中淀粉和細胞壁纖維素）。在模擬測試中，以高信噪比圖像為基準，添加高斯噪聲后，KNS處理的結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（SSIM）和峰值信噪比（PSNR）均優(yōu)于N2V，且避免了深度學習黑箱問題的不確定性
03生物成像應用與多模態(tài)驗證研究在多種生物組織上演示了同時2PM和3PM成像的價值。以新鮮紫杉樹葉為例，2PEF清晰顯示表皮細胞壁的亮條紋和亞細胞暗環(huán)結(jié)構(gòu)，SHG和THG經(jīng)KNS去噪后，分別凸顯葉綠體和細胞內(nèi)部界面信息。在健康人類骨小梁組織中，THG和2PEF信號深度解析了骨細胞及其陷窩-小管網(wǎng)絡(luò)：骨細胞以橢圓形結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，THG對比度源于細胞體與陷窩間的折射率差異界面，2PEF則反映細胞質(zhì)內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）等內(nèi)源熒光團。成像深度方面，2PEF可達170μm，而THG因三光子效應較弱限于100μm以內(nèi)，SHG則展示了膠原纖維的規(guī)則分布，印證樣本健康狀態(tài)。
多模態(tài)圖像的合并進一步體現(xiàn)了KNS的去噪貢獻。未去噪時，低信噪比THG通道的噪聲會掩蓋其他通道細節(jié)；經(jīng)KNS處理后，噪聲顯著抑制，組織特征（如骨細胞小管）清晰可辨，提升了圖像可讀性和分析精度。
創(chuàng)新與亮點
本研究的首要突破是解決了多模態(tài)成像中長期存在的技術(shù)難題。傳統(tǒng)順序采集2PM和3PM圖像時，時間延遲易引入運動偽影和機械漂移，而同時成像通過雙波長同步激發(fā)消除了這一瓶頸。系統(tǒng)設(shè)計上，利用單一激光源頻分雙光束，避免了多激光對齊的復雜性，結(jié)合微型掃描元件，實現(xiàn)了緊湊便攜的架構(gòu)，為在體臨床應用鋪平道路。此外，針對低信號通道的噪聲問題，KNS算法以簡單數(shù)學縮放替代復雜機器學習，在超低信噪比條件下仍能保留組織特征，解決了多模態(tài)圖像合并時的質(zhì)量失衡問題。
在新技術(shù)應用方面，KNS去噪方法的提出是一大亮點。其基于局部核比較的機制，無需訓練數(shù)據(jù)或 ground truth，克服了傳統(tǒng)濾波器的細節(jié)丟失缺陷，也規(guī)避了深度學習對大量數(shù)據(jù)的依賴。算法的高效性使其有望集成于實時成像系統(tǒng)，滿足臨床快速診斷需求。同時，焦距偏移的“副作用”被轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢，通過分散激光能量降低熱損傷，體現(xiàn)了設(shè)計巧思。
該技術(shù)的實際價值在生物醫(yī)療領(lǐng)域尤為突出。無標記成像避免了對樣本的化學處理，保持了組織原生狀態(tài)，特別適用于動態(tài)監(jiān)測活體生物過程。例如，在骨組織研究中，THG對骨細胞陷窩網(wǎng)絡(luò)的成像能力，可為骨質(zhì)疏松等疾病機制研究提供新工具；在植物學中，多模態(tài)對比度能同步揭示細胞壁和葉綠體結(jié)構(gòu)，助力生理學研究。系統(tǒng)的小型化潛力更暗示了未來內(nèi)窺鏡或手持設(shè)備的開發(fā)可能，推動多光子顯微鏡從實驗室走向床邊診斷。總結(jié)與展望
本文報道的緊湊型多模態(tài)MPM系統(tǒng)，通過同時2PM和3PM成像與KNS去噪技術(shù)，實現(xiàn)了高速、高質(zhì)、無標記的生物組織可視化。系統(tǒng)克服了雙波長激發(fā)的信號分離挑
并利用焦距偏移降低熱風險，結(jié)合創(chuàng)新去噪算法，顯著提升了多模態(tài)圖像的實用性和可靠性。實驗證明，該技術(shù)在動物和植物樣本中均能提供互補的結(jié)構(gòu)信息，為生命科學和醫(yī)學研究提供了強大工具。
論文信息
聲明：本文僅用作學術(shù)目的。
Wu W, Brandt C, Zhou X, Tang S. Label-free multimodal imaging with simultaneous two-photon and three-photon microscopy and kernel-based nonlinear scaling denoising. Biomed Opt Express. 2023 Dec 6;15(1):114-130.
DOI:10.1364/BOE.504550.
- 技術(shù)突破：普通SD-OCT即可實現(xiàn)術(shù)中實時三維導航
- 使用行為觀察記錄分析系統(tǒng)探究青少年睡前屏幕使用行為的研究
- 面部表情分析系統(tǒng)助力探究廚具色彩對用戶滿意度的影響
- 共聚焦與熒光成像技術(shù)用于解析高糖下人視網(wǎng)膜類器官的病變
- 光聲計算機斷層掃描三維技術(shù)可視化監(jiān)測小鼠腦脊液動力學
- 心血管炎癥狀態(tài)實時光聲成像技術(shù)無創(chuàng)動態(tài)監(jiān)測動脈粥樣硬化風險
- 新型自適應算法助力三維光聲成像實現(xiàn)大幅降低內(nèi)存使用和計算時間
- 雙光子與光片成像技術(shù)揭示干細胞大小自主調(diào)控機制
