脈沖電磁場(chǎng)介導(dǎo)衰老模型中骨形成的感覺(jué)神經(jīng)調(diào)節(jié)

文獻(xiàn)信息

四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、四川大學(xué)華西醫(yī)院放射科、四川大學(xué)華西醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心等團(tuán)隊(duì)的研究成果“Pulsed electromagnetic fields mediate sensory nerve regulation for bone formation in aging models”（脈沖電磁場(chǎng)介導(dǎo)衰老模型中骨形成的感覺(jué)神經(jīng)調(diào)節(jié)）在學(xué)術(shù)期刊《Nature Communications》（IF=15.7）上發(fā)表。平生公司的小動(dòng)物離活一體Micro CT（型號(hào)：NEMO）產(chǎn)品在論文中提供了重要的小鼠骨骼CT圖像和定量分析。

該研究系統(tǒng)闡明脈沖電磁場(chǎng)抑制骨流失的機(jī)制，并創(chuàng)新性揭示Sema3A促進(jìn)骨形成的新的下游信號(hào)軸，為神經(jīng)-骨交互研究提供了關(guān)鍵證據(jù)。

該研究的通訊作者為洪楨教授。第一作者為王田田副研究員。

文獻(xiàn)摘要
骨質(zhì)疏松癥的核心病理是成骨-破骨耦合失衡，而衰老骨髓微環(huán)境呈“促脂肪-抑成骨”傾向。脈沖電磁場(chǎng)（PEMF）作為無(wú)創(chuàng)、安全的物理療法，臨床已用于骨折延遲愈合和骨質(zhì)疏松，但其促骨形成的分子機(jī)制始終未明。近年發(fā)現(xiàn)骨為高度神經(jīng)支配器官，感覺(jué)神經(jīng)肽（CGRP等）可調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）命運(yùn)，提示“神經(jīng)-骨偶聯(lián)”可能介導(dǎo)物理刺激效應(yīng)。本研究旨在回答：PEMF 是否及如何通過(guò)感覺(jué)神經(jīng)重塑衰老骨髓微環(huán)境，從而逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松表型。作者提出：PEMF 首先激活骨內(nèi)感覺(jué)神經(jīng)，使其分泌軸突導(dǎo)向分子 Sema3A；Sema3A 通過(guò) MSC 表面受體 Nrp1/PlexinA1，抑制細(xì)胞衰老、阻斷成脂分化，并驅(qū)動(dòng) LepR⁺ MSC 向成骨系定向，從而恢復(fù)老化骨中“成骨-成脂”平衡。該假設(shè)解決了領(lǐng)域內(nèi)三大關(guān)鍵問(wèn)題：明確 PEMF 的“第一響應(yīng)細(xì)胞”是感覺(jué)神經(jīng)而非成骨或破骨細(xì)胞；揭示 Sema3A-Nrp1 為神經(jīng)-MSC 對(duì)話的核心分子開關(guān)；闡明衰老微環(huán)境中 MSC 衰老可被物理刺激-Sema3A 信號(hào)逆轉(zhuǎn)，為“促骨形成”而非單純“抑制骨吸收”提供新策略。

脈沖電磁場(chǎng)（PEMFs）可以促進(jìn)骨形成以對(duì)抗骨質(zhì)疏松癥，但其在衰老過(guò)程中促進(jìn)骨健康的機(jī)制尚不清楚。本研究表明，PEMFs可以促進(jìn)衰老雄性小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的新骨形成和神經(jīng)支配，促進(jìn)成骨，減少脂肪生成。在該模型中，感覺(jué)神經(jīng)功能障礙會(huì)削弱PEMFs誘導(dǎo)的成骨。從機(jī)制上講，PEMF刺激感覺(jué)神經(jīng)分泌腦信號(hào)蛋白3A（Sema3A），并且耗盡這些神經(jīng)或敲除Sema3A消除了PEMF的骨形成作用。Sema3A與表達(dá)瘦素受體的MSC中的神經(jīng)纖毛蛋白-1（Nrp1）相互作用，在衰老的雄性小鼠中幫助骨生成和抑制脂肪生成。“Sema3A-Nrp1”途徑的激活對(duì)于PEMF對(duì)MSC的抗衰老作用是重要的，敲除表達(dá)瘦素受體的MSC中的Nrp1會(huì)抵消PEMFs的益處�？偟膩�(lái)說(shuō)，PEMFs刺激感覺(jué)神經(jīng)產(chǎn)生Sema3A，促進(jìn)骨生成，抑制脂肪生成，并對(duì)抗MSC衰老。這強(qiáng)調(diào)了它們?cè)谥委熇夏昴行怨琴|(zhì)疏松癥方面的治療潛力。

實(shí)驗(yàn)方法
PEMF治療
脈沖電磁場(chǎng)組小鼠暴露于脈沖電磁場(chǎng)4周，參數(shù)設(shè)定為頻率8 Hz，強(qiáng)度3.8mT，暴露時(shí)間1 h/d，信號(hào)發(fā)生器產(chǎn)生脈沖猝發(fā)波形（突發(fā)寬度為62.5 ms;脈沖寬度62.5ms）以8Hz重復(fù)，維持3.8 mT的強(qiáng)度和50%的占空比。波形為方形。這些干預(yù)參數(shù)是基于作者以前的研究，這證明了它們?cè)诖龠M(jìn)成骨方面的有效性。在PEMF暴露期間使用外部紅外溫度計(jì)，以確認(rèn)暴露區(qū)域的環(huán)境溫度在整個(gè)過(guò)程中保持穩(wěn)定在24±2℃。此外，暴露持續(xù)時(shí)間和PEMF參數(shù)與先前報(bào)告無(wú)顯著熱效應(yīng)的研究一致。

對(duì)于安慰劑PEMF組，假手術(shù)組的小鼠在暴露室中保持相同的持續(xù)時(shí)間，沒(méi)有任何輸出。在PEMF干預(yù)后，小鼠返回它們的房屋。對(duì)于體外PEMF治療，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中設(shè)置單獨(dú)的磁場(chǎng)裝置，參數(shù)為8 Hz，3.8 mT，每天暴露3小時(shí)。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，使用高斯計(jì)監(jiān)測(cè)線圈內(nèi)的磁場(chǎng)強(qiáng)度，確保每次處理設(shè)備的穩(wěn)定性。

Micro-CT分析
通過(guò)Micro-CT評(píng)估左側(cè)股骨遠(yuǎn)端（NMC-100，平生醫(yī)療科技有限公司），具有以下參數(shù)：70 kV，114 mA和700 ms積分時(shí)間。連續(xù)獲得100幅顯微CT圖像，層間距為10 μm，感興趣區(qū)設(shè)置在長(zhǎng)骨組織遠(yuǎn)端生長(zhǎng)板0.6 ~ 1.5mm范圍內(nèi)，重建結(jié)束時(shí)用Avatar軟件（平生醫(yī)療科技有限公司）重建完整的股骨干骺端三維結(jié)構(gòu)骨小梁的感興趣區(qū)域從遠(yuǎn)端干骺端生長(zhǎng)板近端股骨長(zhǎng)度的5%開始繪制，并向近端延伸股骨總長(zhǎng)度的另外5%。從3D分析數(shù)據(jù)收集以下骨小梁參數(shù)：Tb.BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
PEMFs保護(hù)老年小鼠的骨量
為了研究PEMF對(duì)骨形成的影響，用PEMF處理年輕（4月齡）和老年（20月齡）雄性小鼠（圖1a）。微型計(jì)算機(jī)斷層掃描股骨松質(zhì)骨的（微CT）分析如圖1b所示。PEMF導(dǎo)致股骨松質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）顯著增加（圖1c），骨小梁數(shù)量（Tb.N）（圖1d）和骨小梁厚度（Tb.Th）（圖1 e），以及小梁分離減少（Tb.Sp）（圖1f），與假手術(shù)組相比，在老年小鼠中，而在年輕小鼠中沒(méi)有觀察到這種作用。

圖1 4月齡和20月齡的C57BL/6雄性小鼠用或不用PEMF處理4周。b股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的代表性顯微CT圖像。c-f小梁松質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）的定量，小梁松質(zhì)骨數(shù)量（Tb. N），松質(zhì)骨小梁厚度（Tb. Th）和小梁松質(zhì)骨分離（Tb. Sp），n = 5。

PEMFs通過(guò)感覺(jué)神經(jīng)支配促進(jìn)骨形成
為了研究感覺(jué)神經(jīng)是否參與PEMF誘導(dǎo)的骨形成促進(jìn)，作者通過(guò)將Advillin-Cre小鼠與iDTR野生型（iDTR WT; iDTR^wt）小鼠雜交，在iDTR_Avil−/−小鼠中建立了可誘導(dǎo)的感覺(jué)去神經(jīng)。發(fā)現(xiàn)每周三次給予1μg/kg白喉毒素（DTX），持續(xù)四周，可以有效誘導(dǎo)成年小鼠的感覺(jué)去神經(jīng)，這種治療導(dǎo)致CGRP表達(dá)減少，而PGP9.5的水平保持穩(wěn)定。這表明在iDTR_Avil−/−小鼠中觀察到的去神經(jīng)支配主要影響CGRP陽(yáng)性纖維，而不影響其他感覺(jué)神經(jīng)元。與這些發(fā)現(xiàn)一致，與iDTR_Avil−/−小鼠相比，20月齡的老齡雄性iDTR_Avil−/−小鼠也表現(xiàn)出CGRP陽(yáng)性感覺(jué)神經(jīng)纖維數(shù)量減少。關(guān)于骨體積參數(shù)，作者發(fā)現(xiàn)，與iDTR^wt小鼠相比，20月齡雄性iDTR_Avilfl/−小鼠顯示BV/TV、Tb.N和Tb.Th顯著降低，Tb.Sp顯著增加（圖2a、c-f）。

圖2 在PEMF誘導(dǎo)的骨形成中需要感覺(jué)神經(jīng)支配。20月齡的雄性Adville-Cre：：iDTR（iDTR_Avifl/-）小鼠和iDTR^wt小鼠接受強(qiáng)度為3.8 mT、頻率為8 Hz的PEMF處理1小時(shí)，或不進(jìn)行處理，持續(xù)4周。a股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的代表性顯微CT圖像。c-f骨小梁松質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）的定量，骨小梁松質(zhì)骨數(shù)量（Tb.N），松質(zhì)骨小梁厚度（Tb.Th）和小梁松質(zhì)骨分離（Tb.Sp），每組n = 5。

感覺(jué)神經(jīng)中Sema3a的缺失阻斷了PEMFs對(duì)骨形成的作用
CGRP的免疫染色顯示用PEMF處理的老年Sema 3awt小鼠中感覺(jué)神經(jīng)纖維的數(shù)量顯著增加。相反，在PEMF處理后的Sema 3a KO小鼠中沒(méi)有觀察到這種變化（圖4a）。盡管PEMF導(dǎo)致Sema 3awt老年小鼠中BV/TV、Tb.N和Tb.Th的顯著增加，但在Sema 3a KO小鼠中沒(méi)有觀察到顯著變化（圖4 b，e-g）。

圖4 將20月齡的雄性Adville-Cre：：Sema 3a（Sema 3a_Avifl/-）小鼠和Sema3a flox/flox（Sema3a^wt）小鼠用強(qiáng)度為3.8mT和頻率為8Hz的PEMF處理1小時(shí)，或保持未處理，持續(xù)4周。b.股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的代表性顯微CT圖像。d. CGRP+感覺(jué)神經(jīng)（紅色）的定量分,組n = 5。e-h小梁松質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）的定量，小梁松質(zhì)骨數(shù)量（Tb.N），松質(zhì)骨小梁厚度（Tb.Th）和小梁松質(zhì)骨分離（Tb.Sp）.n = 5。

LepR+ MSCs是感覺(jué)神經(jīng)元的主要靶點(diǎn)
將辣椒素或載體注射到20月齡的LepR-Cre中; tdtomato小鼠1周后建立感覺(jué)神經(jīng)缺失模型，2周后處死小鼠，免疫熒光法證實(shí)感覺(jué)缺失，辣椒素處理后，與假手術(shù)組相比，辣椒素組CGRP+感覺(jué)神經(jīng)數(shù)量明顯減少（圖5a，B）。此外，與假手術(shù)組相比，辣椒素組顯示BV/TV、Tb.Th、Tb.N顯著降低，Tb.Sp增加（圖5c、d）。

圖5 感覺(jué)神經(jīng)元主要靶向LepR+MSCs。c股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的代表性顯微CT圖像。d小梁松質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、小梁松質(zhì)骨數(shù)量的定量（Tb.N），松質(zhì)骨小梁厚度（Tb.Th）和小梁松質(zhì)骨分離（Tb.Sp）. n =每組5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

LepR⁺ MSCs中Nrp1的缺失干擾PEMF誘導(dǎo)的骨形成
與AdvillinCre; iDTR小鼠中的骨表型相似，當(dāng)與假Nrp1^WT小鼠（Nrp1^wt）相比時(shí)，PEMF處理的Nrp1^WT小鼠中的骨形成參數(shù)證明了PEMF誘導(dǎo)的骨形成，而這種作用在Npr 1_LepR-/-小鼠中被消除（圖6d、e）。

圖6 | LepR⁺ MSCs的Nrp1參與了PEMF誘導(dǎo)的骨形成。對(duì)20月齡的雄性LepR-Cre進(jìn)行行為測(cè)試：NRP1（Nrp1_LepR-/-）小鼠和Nrp 1 flox/flox（Nrp1^wt）小鼠。d-j用強(qiáng)度為3.8 mT、頻率為8 Hz的PEMF處理20月齡雄性Nrp1_LepR-/-小鼠和Nrp1^wt小鼠1小時(shí)，或保持未處理。d股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的代表性顯微CT圖像。e小梁松質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）的定量，小梁松質(zhì)骨數(shù)量（Tb.N）、小梁松質(zhì)骨厚度（Tb.Th）和小梁松質(zhì)骨分離（Tb.Sp）。n = 5。

 Micro CT (型號(hào)：NEMO) (平生醫(yī)療科技)
影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）