HA Peptide-MCE
HA Peptide (HA tag) 是來(lái)自人類流感血凝素 (HA) 的由九個(gè)氨基酸組成的多肽。HA Peptide 廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)中分離，純化，檢測(cè)和追蹤目標(biāo)蛋白。
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
生物活性
體外研究
一、HA 標(biāo)簽化的 Hop 蛋白檢測(cè)[3]
1. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與蛋白質(zhì)表達(dá)
(1) 選擇 HEK293T 細(xì)胞，培養(yǎng)在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中。
(2) 通過(guò)轉(zhuǎn)染，使用 pcDNA3.1-HOP wt-HA 載體將編碼 HA 標(biāo)簽的 Hop 蛋白基因轉(zhuǎn)染入 HEK293T 細(xì)胞。對(duì)照組使用不含目標(biāo)基因的載體。
(3) 轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)，用 PBS 洗滌細(xì)胞，收集細(xì)胞進(jìn)行裂解。
2. 細(xì)胞裂解與蛋白提取
(1) 將裂解緩沖液（含 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 250 mM sucrose, 5 mM MgCl2, 1% IGEPAL, 1 mM DTT 及蛋白酶抑制劑）加入到收集的細(xì)胞中，室溫下孵育 10 分鐘。
(2) 通過(guò)離心 (16,100 g, 10 分鐘) 分離細(xì)胞裂解液，去除細(xì)胞沉淀。
(3) 收集上清液，測(cè)定蛋白濃度并準(zhǔn)備樣品。
3. 蛋白質(zhì)分離
(1) 將蛋白樣品分為不同稀釋比例 (如 1:2 和 1:10)，根據(jù)蛋白濃度，取 30 μg 樣品加載至 10% SDS-PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳。
(2) 電泳結(jié)束后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。
4. 蛋白免疫印跡（Western Blot）
(1) 將轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜在封閉液中 (含 5% 非脂奶粉, TBS, 0.2% Tween 20 或 IGEPAL) 封閉 30 分鐘。
(2) 將膜與目標(biāo)抗體 (如 AF291 或 AE391 抗 HA 抗體，稀釋度 1:1000) 在 TBS 緩沖液中孵育 1 小時(shí)。
(3) 使用抗 GAPDH 抗體作為載入對(duì)照 (稀釋度 1:5000)，同時(shí)孵育。
(4) 洗滌膜 3 次，每次 15 分鐘，使用含 0.2% Tween 20 或 IGEPAL 的 TBS 洗滌。
(5) 將膜與 HRP 標(biāo)記的二抗孵育 1 小時(shí)，稀釋度為 1:10,000。
(6) 再次洗滌膜 3 次，每次 15 分鐘。
(7) 使用 ECL 顯色試劑進(jìn)行蛋白顯色，通過(guò)成像系統(tǒng)捕捉信號(hào)。
5. 結(jié)果分析
(1) 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，檢查 HA 標(biāo)簽蛋白的信號(hào)強(qiáng)度。
(2) 注意 AF291 和 AE391 抗體可能會(huì)識(shí)別多個(gè)與目標(biāo)蛋白無(wú)關(guān)的內(nèi)源性蛋白，因此需與對(duì)照抗體 (如 HA.11 抗體) 對(duì)比結(jié)果，以確保結(jié)果的特異性。
二、通過(guò) HA Peptide 構(gòu)建大腸桿菌中 T7 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 HtrA1 基因表達(dá)系統(tǒng)[4]
(1) pHA-M-HtrA1 質(zhì)粒構(gòu)建：
(a) 使用 EcoRI 和 XhoI 酶切 pcDNA3-HA 和 pBS-M-HtrA1 質(zhì)粒，從而使 HtrA1 的 N 端與 HA tag 融合。
(b) 以 pHA-M-HtrA1 質(zhì)粒為模板，使用特定的引物對(duì) (Forward primer: ATCGATATGTACCCTTACGATGTACCG; Reverse primer: CTCGAGCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTA) 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 M-HtrA1 cDNA 片段。擴(kuò)增出的 M-HtrA1 cDNA 片段同樣用 EcoRI 和 XhoI 酶切。
(c) 將酶切后的 M-HtrA1 cDNA 片段插入 pcDNA3.0 質(zhì)粒中，完成構(gòu)建。
(2) 大腸桿菌活性檢測(cè)
將 pHA-M-HtrA1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大腸桿菌 TOP10 細(xì)胞，大腸桿菌 TOP10 細(xì)胞接種于含有 50 μg/ml Ampicillin (HY-B0522) 的 Luria-Bertani 培養(yǎng)基 (LB-Amp)，并在 37 ℃ 下培養(yǎng)。通過(guò)監(jiān)測(cè) OD600 值來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)情況。
(3) 通過(guò)免疫印跡分析 (IB) 測(cè)定 HtrA1 表達(dá)
(a) N 端融合有 HA 標(biāo)簽的 HtrA1 基因可通過(guò) IB 檢測(cè)到。
(b) N 端融合有 HA 標(biāo)簽的 Parkin 蛋白在大腸桿菌載體中表達(dá)量上升。
總結(jié)：通過(guò)構(gòu)建 HA Peptide 標(biāo)記的大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)，來(lái)快速檢測(cè)靶基因表達(dá)和大腸桿菌細(xì)胞活性的影響，從而用作哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)試工具。
參考文獻(xiàn)
[3]. Keszei Z, et al. AF291 and AE391 single-chain antibodies recognize the HA tag by Western blotting[J]. Antibody Reports, 2019: e25-e25.
[4]. Moon JM, et al. A new idea for simple and rapid monitoring of gene expression: requirement of nucleotide sequences encoding an N-terminal HA tag in the T7 promoter-driven expression in E. coli. Biotechnol Lett. 2012 Oct;34(10):1841-6
MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)
生物活性
體外研究
一、HA 標(biāo)簽化的 Hop 蛋白檢測(cè)[3]
1. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與蛋白質(zhì)表達(dá)
(1) 選擇 HEK293T 細(xì)胞，培養(yǎng)在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中。
(2) 通過(guò)轉(zhuǎn)染，使用 pcDNA3.1-HOP wt-HA 載體將編碼 HA 標(biāo)簽的 Hop 蛋白基因轉(zhuǎn)染入 HEK293T 細(xì)胞。對(duì)照組使用不含目標(biāo)基因的載體。
(3) 轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)，用 PBS 洗滌細(xì)胞，收集細(xì)胞進(jìn)行裂解。
2. 細(xì)胞裂解與蛋白提取
(1) 將裂解緩沖液（含 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 250 mM sucrose, 5 mM MgCl2, 1% IGEPAL, 1 mM DTT 及蛋白酶抑制劑）加入到收集的細(xì)胞中，室溫下孵育 10 分鐘。
(2) 通過(guò)離心 (16,100 g, 10 分鐘) 分離細(xì)胞裂解液，去除細(xì)胞沉淀。
(3) 收集上清液，測(cè)定蛋白濃度并準(zhǔn)備樣品。
3. 蛋白質(zhì)分離
(1) 將蛋白樣品分為不同稀釋比例 (如 1:2 和 1:10)，根據(jù)蛋白濃度，取 30 μg 樣品加載至 10% SDS-PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳。
(2) 電泳結(jié)束后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。
4. 蛋白免疫印跡（Western Blot）
(1) 將轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜在封閉液中 (含 5% 非脂奶粉, TBS, 0.2% Tween 20 或 IGEPAL) 封閉 30 分鐘。
(2) 將膜與目標(biāo)抗體 (如 AF291 或 AE391 抗 HA 抗體，稀釋度 1:1000) 在 TBS 緩沖液中孵育 1 小時(shí)。
(3) 使用抗 GAPDH 抗體作為載入對(duì)照 (稀釋度 1:5000)，同時(shí)孵育。
(4) 洗滌膜 3 次，每次 15 分鐘，使用含 0.2% Tween 20 或 IGEPAL 的 TBS 洗滌。
(5) 將膜與 HRP 標(biāo)記的二抗孵育 1 小時(shí)，稀釋度為 1:10,000。
(6) 再次洗滌膜 3 次，每次 15 分鐘。
(7) 使用 ECL 顯色試劑進(jìn)行蛋白顯色，通過(guò)成像系統(tǒng)捕捉信號(hào)。
5. 結(jié)果分析
(1) 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，檢查 HA 標(biāo)簽蛋白的信號(hào)強(qiáng)度。
(2) 注意 AF291 和 AE391 抗體可能會(huì)識(shí)別多個(gè)與目標(biāo)蛋白無(wú)關(guān)的內(nèi)源性蛋白，因此需與對(duì)照抗體 (如 HA.11 抗體) 對(duì)比結(jié)果，以確保結(jié)果的特異性。
二、通過(guò) HA Peptide 構(gòu)建大腸桿菌中 T7 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 HtrA1 基因表達(dá)系統(tǒng)[4]
(1) pHA-M-HtrA1 質(zhì)粒構(gòu)建：
(a) 使用 EcoRI 和 XhoI 酶切 pcDNA3-HA 和 pBS-M-HtrA1 質(zhì)粒，從而使 HtrA1 的 N 端與 HA tag 融合。
(b) 以 pHA-M-HtrA1 質(zhì)粒為模板，使用特定的引物對(duì) (Forward primer: ATCGATATGTACCCTTACGATGTACCG; Reverse primer: CTCGAGCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTA) 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 M-HtrA1 cDNA 片段。擴(kuò)增出的 M-HtrA1 cDNA 片段同樣用 EcoRI 和 XhoI 酶切。
(c) 將酶切后的 M-HtrA1 cDNA 片段插入 pcDNA3.0 質(zhì)粒中，完成構(gòu)建。
(2) 大腸桿菌活性檢測(cè)
將 pHA-M-HtrA1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大腸桿菌 TOP10 細(xì)胞，大腸桿菌 TOP10 細(xì)胞接種于含有 50 μg/ml Ampicillin (HY-B0522) 的 Luria-Bertani 培養(yǎng)基 (LB-Amp)，并在 37 ℃ 下培養(yǎng)。通過(guò)監(jiān)測(cè) OD600 值來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)情況。
(3) 通過(guò)免疫印跡分析 (IB) 測(cè)定 HtrA1 表達(dá)
(a) N 端融合有 HA 標(biāo)簽的 HtrA1 基因可通過(guò) IB 檢測(cè)到。
(b) N 端融合有 HA 標(biāo)簽的 Parkin 蛋白在大腸桿菌載體中表達(dá)量上升。
總結(jié)：通過(guò)構(gòu)建 HA Peptide 標(biāo)記的大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)，來(lái)快速檢測(cè)靶基因表達(dá)和大腸桿菌細(xì)胞活性的影響，從而用作哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)試工具。
參考文獻(xiàn)
[3]. Keszei Z, et al. AF291 and AE391 single-chain antibodies recognize the HA tag by Western blotting[J]. Antibody Reports, 2019: e25-e25.
[4]. Moon JM, et al. A new idea for simple and rapid monitoring of gene expression: requirement of nucleotide sequences encoding an N-terminal HA tag in the T7 promoter-driven expression in E. coli. Biotechnol Lett. 2012 Oct;34(10):1841-6
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