將三聚化增強(qiáng)的NIR-II/光聲納米探針應(yīng)用于骨肉瘤精確成像

本文要點(diǎn)：光聲成像（PAI）與近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像的融合在癌癥診斷領(lǐng)域具有變革性潛力，但高性能雙模態(tài)造影劑的開發(fā)仍面臨挑戰(zhàn)。作者報道了一種通過熒光團(tuán)三聚化設(shè)計(jì)的有機(jī)納米探針tH7@CT8，以解決小分子制劑光熱轉(zhuǎn)換效率的局限。[1,2,5]噻二唑并[3,4-g]喹喔啉熒光團(tuán)衍生物H7三聚化誘導(dǎo)聚集，在抑制熒光量子產(chǎn)率（0.11% vs 單體0.42%）的同時將光熱轉(zhuǎn)換效率提升至43.1%。經(jīng)骨肉瘤靶向兩親性基質(zhì)包覆形成的納米顆粒（72±19 nm），其腫瘤攝取量較非靶向?qū)φ战M增強(qiáng)4倍。在原位骨肉瘤模型中，tH7@CT8實(shí)現(xiàn)了光聲成像檢測及實(shí)時NIR-II手術(shù)導(dǎo)航，腫瘤信噪比>12:1。該研究確立了平衡腫瘤學(xué)中穿透深度與分辨率矛盾的分子設(shè)計(jì)策略，同時推動有機(jī)造影劑向臨床轉(zhuǎn)化。

 

 

---

 

研究者們通過將三聚NIR-II熒光團(tuán)（tH7）封裝于配體功能化的兩親性基質(zhì)中，獲得了腫瘤靶向納米探針tH7@CT8。[1,2,5]噻二唑并[3,4-g]喹喔啉（TQ）衍生物H7的三聚化誘導(dǎo)受控聚集，在淬滅熒光發(fā)射（量子產(chǎn)率0.11% vs 單體0.42%）的同時，將光熱轉(zhuǎn)換效率（PTCE）提升至43.1%，顯著超越臨床用吲哚菁綠（ICG, 22%）。分子動力學(xué)模擬揭示三聚體平面化促進(jìn)π-π堆疊，從而將激發(fā)態(tài)能量導(dǎo)向非輻射衰變路徑。骨肉瘤靶向配體CT8的引入進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤選擇性富集。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，tH7@CT8能通過光聲成像精準(zhǔn)勾勒深達(dá)1厘米組織的毫米級骨肉瘤病灶。本研究建立的分子工程策略能夠協(xié)調(diào)癌癥診斷中穿透深度與分辨率矛盾，為先進(jìn)有機(jī)納米材料在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)中的臨床轉(zhuǎn)化開辟道路。

圖1. tH7的合理分子設(shè)計(jì)、合成路線及光物理表征

 

通過合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)構(gòu)建的共價三聚體tH7，可調(diào)控雙模態(tài)成像所需的關(guān)鍵光物理性質(zhì)�；�于TQ的熒光團(tuán)H7三聚化（圖1a）誘導(dǎo)吸收/發(fā)射光譜紅移，同時增強(qiáng)非輻射衰變路徑——這是提升光熱轉(zhuǎn)換效率（PTCE）的核心機(jī)制。采用B3LYP雜化泛函與6-31G(d)基組的密度泛函理論（DFT）模擬闡明三聚化引發(fā)的電子結(jié)構(gòu)改變：前沿分子軌道分析顯示最高占據(jù)軌道（HOMO）中π電子離域分布于共軛骨架，而缺電子TQ受體主導(dǎo)最低未占軌道（LUMO，圖1b）。值得注意的是，三聚化使HOMO-LUMO能隙（ΔEgap）從1.68 eV（H7）降至1.18 eV（tH7），超越苯并雙噻二唑基NIR-II熒光團(tuán)1.50 eV閾值，表明近紅外吸收特性顯著增強(qiáng)。

光學(xué)表征證實(shí)三聚化誘導(dǎo)的光譜調(diào)控：在二氯甲烷中，tH7最大吸收峰位于864 nm（ε=1.4×10⁵ M⁻¹ cm⁻¹），NIR-II熒光發(fā)射峰為1192 nm，斯托克斯位移達(dá)328 nm（圖1d），有效降低活體激發(fā)散射干擾。在水相介質(zhì)中呈現(xiàn)聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）效應(yīng)：80%含水率（fw）時的熒光強(qiáng)度較純THF提升2.9倍（圖1e），歸因于三苯胺供體分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限。該AIE效應(yīng)與聚集增強(qiáng)的PTCE（43.1%）協(xié)同作用，使tH7成為光聲/熒光生物成像的范式轉(zhuǎn)換型探針。

 

圖2. tH7納米粒子的光物理表征

 

為使疏水性NIR-II熒光團(tuán)tH7在水相介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)生物應(yīng)用，采用納米沉淀法將其封裝于1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-3.4k]（DSPE-PEG3.4k）兩親性基質(zhì)中。透射電鏡顯示形成單分散球形納米顆粒（tH7納米粒子），核心直徑為56±15 nm（圖2a）。動態(tài)光散射測定流體動力學(xué)直徑為181±44 nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.06，符合聚乙二醇化納米顆粒結(jié)構(gòu)特征。

分光光度分析證實(shí)水相環(huán)境中光譜紅移：tH7納米粒子最大吸收峰位于855 nm，NIR-II發(fā)射峰為1200 nm（圖2b）。吸收度（864 nm）與濃度（1-50 μM）呈線性相關(guān)（R²=0.998），符合朗伯-比爾定律（圖2c）。經(jīng)HPLC-UV定量（λ=864 nm）測得封裝效率達(dá)72.5±11.4%。光聲表征在860 nm處顯示峰值信號強(qiáng)度（圖2d），與光學(xué)吸收特性吻合。同等濃度（100 μM）下，tH7納米粒子光聲振幅達(dá)吲哚菁綠（ICG）的3.70倍（圖2e），在雞胸肉組織中的穿透深度>9毫米（圖2f）；而NIR-II成像模式下穿透深度限于7毫米（圖2f）。此增強(qiáng)效應(yīng)源于其43.1%的優(yōu)異光熱轉(zhuǎn)換效率，該值通過Roper法在808 nm激光（1 W cm⁻²）照射下測定。實(shí)時熱成像顯示300 μM濃度樣品在150秒內(nèi)溫度從23.1℃快速升至89.7℃（圖2g）。連續(xù)近紅外照射（808 nm, 1 W cm⁻²）下的光穩(wěn)定性評估表明：tH7納米粒子60分鐘后保留88±5%初始熒光強(qiáng)度，顯著優(yōu)于ICG的37±6%（圖2h）。靜置保存7天后粒徑增大約50%，但未觀察到沉淀。在水、PBS（pH 7.4）、DMEM及10%胎牛血清等生理介質(zhì)中熒光強(qiáng)度變化<5%，證實(shí)其膠體穩(wěn)定性與光學(xué)穩(wěn)定性滿足體內(nèi)應(yīng)用需求（圖2i）。

 

圖3. 靶向功能化與生物安全性評價tH7@CT8納米顆粒

 

為實(shí)現(xiàn)骨肉瘤靶向成像，通過馬來酰亞胺-巰基點(diǎn)擊化學(xué)將CT-8（一種源自噬菌體展示優(yōu)化肽PT-7的半胱氨酸修飾寡肽CPPSHTPT）修飾于tH7納米粒子表面。MALDI-TOF質(zhì)譜證實(shí)DSPE-PEG3.4k-CT8成功合成（圖3a），837.8 Da的質(zhì)量位移對應(yīng)CT-8連接。在納米顆�；�質(zhì)中摻入30 mol% DSPE-PEG3.4k-CT8制得tH7@CT8納米粒子，其ζ電位從-23.3 mV升至-19.1 mV（圖3b），與CT-8理論等電點(diǎn)（pI=8.2）一致。TEM（72±19 nm）與DLS（223±60 nm, PDI=0.07）顯示tH7@CT8粒徑較tH7納米粒子增大約30%，歸因于表面肽鏈包覆。

為驗(yàn)證修飾后CT-8靶向特異性，通過6-氨基己酸（Ahx）間隔臂將FITC共價偶聯(lián)至CT-8制得FITC-CT-8。質(zhì)譜確證合成成功，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示：143B細(xì)胞與FITC-CT-8孵育后FITC通道信號顯著增強(qiáng)（平均熒光強(qiáng)度MFI≈20），顯著高于陰性對照組（成骨細(xì)胞hFOB 1.19與乳腺癌MCF-7細(xì)胞，MFI<8）；CT-8預(yù)封閉組MFI降至陰性對照水平。熒光共聚焦成像進(jìn)一步佐證該特異性。

體外NIR-II熒光成像驗(yàn)證tH7@CT8靶向能力：骨肉瘤143B細(xì)胞相對MFI（6.4±1.4）為hFOB 1.19細(xì)胞（1.5±0.2）的4.3倍、MCF-7細(xì)胞（2.2±0.3）的2.9倍（*p<0.05，方差分析聯(lián)合Tukey檢驗(yàn)，圖3d）。CCK-8毒性實(shí)驗(yàn)顯示：tH7@CT8（0-50 μg mL⁻¹）處理24小時后，143B與NIH/3T3細(xì)胞存活率>90%（圖3e）。藥代動力學(xué)研究測得血液循環(huán)半衰期為53分鐘（圖3f）。

圖4. 皮下骨肉瘤的NIR-II熒光和光聲雙模成像

 

在143B骨肉瘤皮下移植瘤Balb/c裸鼠模型（n=3）中評估了tH7@CT8納米顆粒的腫瘤靶向效能與藥代動力學(xué)特性。靜脈注射tH7@CT8納米粒子（2.5 μmol kg⁻¹, 200 μL PBS）可實(shí)現(xiàn)實(shí)時NIR-II熒光成像（808 nm激發(fā)，0.3 W cm⁻²；1000 nm長通濾光片，100 ms曝光，圖4a）：注射后1小時即可檢測到右后肢腫瘤特異性信號，12小時達(dá)到峰值信背比（SBR=9.8±1.4，圖4a/b）。24小時信號衰減（SBR=5.6±0.5）與肝臟清除動力學(xué)相關(guān)，離體器官成像顯示納米顆粒主要富集于肝臟（29±11% ID/g）和脾臟（160±70% ID/g）（圖4c）。

預(yù)注射游離CT-8肽（2 mg）的競爭抑制實(shí)驗(yàn)使12小時腫瘤熒光強(qiáng)度降低76%（SBR=2.4±0.3 vs 9.8±1.4,**p<0.01，圖4a/b），證實(shí)受體介導(dǎo)靶向；而注射1小時殘余信號（SBR=3.5±0.2）源于增強(qiáng)滲透滯留（EPR）效應(yīng)的被動蓄積。

光聲層析成像在注射后10小時以150 μm分辨率呈現(xiàn)腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)（圖4d）。860 nm激發(fā)光聲縱向監(jiān)測顯示：腫瘤信號藥代動力學(xué)特征與NIR-II熒光數(shù)據(jù)一致，10小時達(dá)峰值（SBR=20.2±6.2，圖4d/e）。游離CT-8肽競爭抑制使10小時光聲強(qiáng)度降低72%（SBR=5.7±1.0,*p<0.05），定量驗(yàn)證受體靶向機(jī)制。時序相關(guān)性分析證實(shí)光聲與NIR-II信號動力學(xué)高度同步。該雙模態(tài)平臺整合NIR-II實(shí)時導(dǎo)航（100 ms幀率）與光聲深度分辨成像（150 μm分辨率），為術(shù)中腫瘤精準(zhǔn)定位提供診斷方案。

圖5. NIR-II/光聲雙模態(tài)原位骨肉瘤成像

 

原位骨肉瘤模型較皮下移植瘤更精準(zhǔn)地復(fù)現(xiàn)人類疾病進(jìn)程，其保留的腫瘤-基質(zhì)相互作用及轉(zhuǎn)移潛能對診斷探針評估至關(guān)重要。本研究于小鼠右脛骨建立143B原位骨肉瘤模型（n=3，圖5a），X線成像驗(yàn)證顯示骨皮質(zhì)破壞（骨礦物密度較對照組降低~60%，圖5b）。靜脈注射tH7@CT8納米粒子（2.5 μmol kg⁻¹）實(shí)現(xiàn)縱向NIR-II熒光成像（808 nm激發(fā)，1000 nm長通濾光片，圖5c）：注射后3小時出現(xiàn)腫瘤特異性信號（SBR=2.8±0.6），12小時達(dá)峰值（SBR=11.9±3.7），24小時仍維持顯著對比度（SBR=7.5±0.8，圖5d）。假手術(shù)處理左脛骨始終呈背景水平信號（SBR=1.3±0.3），排除手術(shù)偽影干擾。CT-8肽競爭抑制使12小時腫瘤信背比降低56%（5.2±1.0,*p<0.05），證實(shí)靶向能力。

同步光聲層析成像（860 nm, 1.5 MHz，圖5e）顯示隨時間遞進(jìn)的腫瘤增強(qiáng)效應(yīng)，10小時達(dá)峰值（光聲信號：3.5±0.8 au vs 注射前0.5±0.1 au,*p<0.05）。封閉組光聲信號降低57%（1.5±0.3 au），假手術(shù)對照組保持基線水平（0.8±0.2 au）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后截取后肢（圖5f）行組織病理學(xué)分析（H&E染色），結(jié)果顯示tH7@CT8組與封閉組的骨肉瘤區(qū)域及形態(tài)學(xué)特征均與成像結(jié)果吻合（圖5g）。

 

本研究構(gòu)建了tH7@CT8有機(jī)納米探針，其通過精準(zhǔn)分子工程協(xié)調(diào)光聲成像深度分辨率與NIR-II熒光靈敏度。利用TQ衍生物三聚化，通過受控π-π堆疊實(shí)現(xiàn)43.1%光熱轉(zhuǎn)換效率，在將激發(fā)態(tài)能量導(dǎo)向非輻射衰變路徑的同時，保留實(shí)時導(dǎo)航所需的熒光量子產(chǎn)率（0.11%）。分子動力學(xué)模擬揭示平面三聚體構(gòu)象增強(qiáng)分子間電荷轉(zhuǎn)移，CT8靶向納米粒的腫瘤蓄積量較非靶向?qū)φ战M提升4倍。tH7@CT8能在0.9厘米深度實(shí)現(xiàn)亞毫米級腫瘤邊緣勾勒，并達(dá)成>12:1的NIR-II腫瘤信噪比，性能超越現(xiàn)有雙模態(tài)制劑。競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)經(jīng)76%攝取抑制率證實(shí)受體特異性靶向。未來轉(zhuǎn)化需將光譜拓展至NIR-IIb波段（1500-1700 nm）以增強(qiáng)穿透深度，并整合微環(huán)境響應(yīng)基團(tuán)實(shí)現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性動態(tài)圖譜繪制。本研究論證的寡聚化驅(qū)動能量平衡范式——通過分子調(diào)控優(yōu)化輻射/非輻射衰變比例——為診斷探針開發(fā)提供普適性設(shè)計(jì)藍(lán)圖。

 

參考文獻(xiàn)

Siyu Lu, et al. "Trimerization-Enhanced NIR-II/Photoacoustic Nanoprobes for Precision Osteosarcoma Imaging." Analytical Chemistry . 2025, 97, 46, 25701–25711

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

In Vivo Imaging System

高靈敏度 - 采用深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm
高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um
熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us
高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）
多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、光聲和光熱成像、原位成像光譜，CT等
顯微鏡 - 高分辨顯微成像系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀
 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

 恒光智影

上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，被評為“國家高新技術(shù)企業(yè)”、“上海市專精特新中小企業(yè)”，獲國家科技部“重大科學(xué)儀器研發(fā)專項(xiàng)”支持，榮獲上海市“科技創(chuàng)新行動計(jì)劃”科學(xué)儀器項(xiàng)目、上海市2025年度關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)計(jì)劃“計(jì)算生物學(xué)”項(xiàng)目。

恒光智影，致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供先進(jìn)的、一體化的成像解決方案。

專注動物活體成像技術(shù)，成像范圍覆蓋 400-1700 nm，同時可整合CT, X-ray，超聲，光聲，光熱成像等技術(shù)。

可為腫瘤藥理、神經(jīng)藥理、心血管藥理、大分子藥代動力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，為用戶提供前沿的生物醫(yī)藥與科學(xué)儀器服務(wù)。