突破：一種使小鼠腦皮層100-400微米深度熒光增強(qiáng)的生物傳感器
在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，L-乳酸日益被視為一種重要的細(xì)胞間能量載體，但其在細(xì)胞外環(huán)境中釋放與攝取的空間和時(shí)間動(dòng)態(tài)變化仍存在諸多未解之謎。傳統(tǒng)監(jiān)測方法如酶電極技術(shù)，雖能用于活體測量，但存在空間分辨率低、對(duì)組織具有侵入性等局限。為了以更高的時(shí)空分辨率在活體中原位、實(shí)時(shí)觀測細(xì)胞外L-乳酸的動(dòng)態(tài)變化，研究人員開發(fā)了一種名為R-eLACCO2.1的紅色熒光基因編碼生物傳感器。該傳感器基于乳酸結(jié)合蛋白TTHA0766與紅色熒光蛋白cpmApple構(gòu)建，通過定向進(jìn)化與優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了在培養(yǎng)細(xì)胞、小鼠腦切片以及活體小鼠中對(duì)細(xì)胞外L-乳酸的高靈敏度、高特異性成像。R-eLACCO2.1不僅可用于熒光強(qiáng)度成像，還可作為熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）傳感器，并能與綠色熒光鈣離子指示劑（如GCaMP）進(jìn)行雙色成像，從而同步監(jiān)測神經(jīng)活動(dòng)與代謝變化。
本研究的核心貢獻(xiàn)者包括Yuki Kamijo, Philipp Machler, Natalie Ness, Cong Quang Vu, Tsukasa Kusakizako, Jamsad Mannuthodikayil, Zaneta Ku, Marc Boisvert, Ekaterina Grebenik, Ikumi Miyazaki, Rina Hashizume, Haruaki Sato, Rui Liu, Yukiko Hori, Taisuke Tomita, Tetsuro Katayama, Akihiro Furube, Gabriela Caraveo, Marie-Eve Paquet, Mikhail Drobizhev, Osamu Nureki, Satoshi Arai, Marco Brancaccio, Robert E. Campbell, David Kleinfeld & Yusuke Nasu。他們的研究成果以論文“A red fluorescent genetically encoded biosensor for in vivo imaging of extracellular L-lactate dynamics”的形式，于2025年10月發(fā)表在學(xué)術(shù)期刊《Nature Communications》上。
重要發(fā)現(xiàn)
01核心貢獻(xiàn)：新一代紅色熒光乳酸傳感器的誕生
本研究最核心的貢獻(xiàn)是成功開發(fā)了R-eLACCO2.1，這是首個(gè)高性能的紅色熒光細(xì)胞外L-乳酸基因編碼生物傳感器。其開發(fā)過程始于將綠色乳酸傳感器eLACCO1中的綠色熒光蛋白（cpGFP）替換為紅色熒光蛋白（cpmApple），構(gòu)建出初始原型R-eLACCO0.1。隨后，研究團(tuán)隊(duì)通過多輪定向進(jìn)化（包括隨機(jī)突變和定點(diǎn)誘變），大幅提升了傳感器的熒光響應(yīng)度（ΔF/F），最終獲得了高度優(yōu)化的變體R-eLACCO2。通過引入Leu79Ile突變以調(diào)節(jié)其對(duì)乳酸的親和力，得到了最終的工作版本R-eLACCO2.1，其表觀Kd為5.1 mM，非常適合感知生理范圍內(nèi)的細(xì)胞外乳酸濃度變化。同時(shí)，研究人員還構(gòu)建了無響應(yīng)突變體R-deLACCOctrl作為對(duì)照。
在光學(xué)特性上，R-eLACCO2.1展現(xiàn)出卓越的性能。在結(jié)合L-乳酸后，其最大激發(fā)峰從578 nm藍(lán)移至566 nm，最大發(fā)射峰從602 nm藍(lán)移至594 nm，這種激發(fā)光譜的位移是其在比率式或強(qiáng)度測量中產(chǎn)生高對(duì)比度響應(yīng)的基礎(chǔ)。其熒光壽命也會(huì)隨乳酸濃度增加而顯著變化（Δτ ≈ 0.37 ns），這使其成為一種有效的FLIM生物傳感器。FLIM技術(shù)的優(yōu)勢在于其信號(hào)不受傳感器表達(dá)濃度、激發(fā)光功率和焦點(diǎn)漂移的影響，非常適合在復(fù)雜的活體環(huán)境中進(jìn)行定量成像。此外，R-eLACCO2.1在雙光子激發(fā)下也表現(xiàn)出良好的特性，使其能夠用于深層組織成像。研究人員還通過冷凍電鏡技術(shù)解析了R-eLACCO2在乳酸結(jié)合狀態(tài)下的高分辨率結(jié)構(gòu)（2.7 Å），揭示了其分子內(nèi)部關(guān)鍵氨基酸殘基（如Lys211）在乳酸結(jié)合后通過調(diào)控發(fā)色團(tuán)微環(huán)境來改變熒光性質(zhì)的機(jī)制。
03細(xì)胞表面定位的精準(zhǔn)優(yōu)化
對(duì)于細(xì)胞外靶向的傳感器而言，能否高效且特異地定位到細(xì)胞膜表面至關(guān)重要。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)此進(jìn)行了系統(tǒng)性優(yōu)化。他們篩選了多種C-末端錨定域（包括基于蛋白質(zhì)的跨膜域和基于糖基磷脂酰肌醇GPI的錨）以及N-末端信號(hào)肽序列。結(jié)果表明，GPI錨定系統(tǒng)（如COBRA, CD59, GFRA1）能實(shí)現(xiàn)高效的細(xì)胞表面定位，而蛋白質(zhì)跨膜錨定效果不佳。在信號(hào)肽篩選中，大多數(shù)序列也能引導(dǎo)傳感器到達(dá)膜上，其中IgK、HA和pat-3序列能帶來最亮的熒光信號(hào)。最終，結(jié)合熒光響應(yīng)度（ΔF/F）測試，確定IgK信號(hào)肽與COBRA GPI錨的組合為R-eLACCO2.1的最佳配置，使其在HeLa細(xì)胞中ΔF/F高達(dá)6.5，遠(yuǎn)超早期版本。
04在活體成像中的突破性應(yīng)用
研究的最終目的是在活體動(dòng)物中驗(yàn)證傳感器的功能。研究人員通過向小鼠初級(jí)觸覺體感皮層（vS1）注射腺相關(guān)病毒（AAV），使神經(jīng)元特異性表達(dá)R-eLACCO2.1。靜脈注射L-乳酸后，利用雙光子激光掃描顯微鏡結(jié)合自適應(yīng)光學(xué)（AO2P）技術(shù)，在清醒小鼠大腦皮層100微米和400微米深度均觀察到了R-eLACCO2.1強(qiáng)烈的熒光強(qiáng)度增加，且其信號(hào)變化與植入同一腦區(qū)的電化學(xué)乳酸探針的記錄結(jié)果高度相關(guān)，證實(shí)了其在活體內(nèi)的可靠性。更重要的是，R-eLACCO2.1的性能優(yōu)于此前報(bào)道的綠色傳感器eLACCO2.1，在活體中具有更高的靈敏度。
更引人入勝的是對(duì)內(nèi)源性乳酸動(dòng)態(tài)的觀測。在清醒小鼠中，吹動(dòng)胡須刺激或小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)后，V1S區(qū)層II/III神經(jīng)元的細(xì)胞外L-乳酸水平均呈現(xiàn)顯著上升。而通過雙色成像技術(shù)，研究人員實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一批神經(jīng)元同時(shí)記錄R-eLACCO2.1（報(bào)告細(xì)胞外乳酸）和GCaMP6f（報(bào)告細(xì)胞內(nèi)鈣離子，即神經(jīng)活動(dòng)）。令人驚訝的是，在無明顯運(yùn)動(dòng)事件的自發(fā)神經(jīng)活動(dòng)期間，他們觀察到神經(jīng)激活（GCaMP6f信號(hào)升高）之后，細(xì)胞外乳酸濃度會(huì)出現(xiàn)一個(gè)短暫的下降，隨后才恢復(fù)至基線水平。這一發(fā)現(xiàn)暗示了神經(jīng)活動(dòng)可能伴隨著局部乳酸的快速消耗，為了解大腦代謝與神經(jīng)活動(dòng)之間的復(fù)雜互動(dòng)提供了全新的視角。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
R-eLACCO2.1的誕生，在光學(xué)成像與生物傳感領(lǐng)域取得了多項(xiàng)重要突破。它成功突破了光譜限制，實(shí)現(xiàn)了活體代謝物的多參數(shù)同步成像。作為首個(gè)紅色熒光細(xì)胞外乳酸傳感器，它完美地解決了綠色熒光傳感器（如eLACCO系列）與同樣為綠色的神經(jīng)活動(dòng)指示劑（如GCaMP）在同時(shí)使用時(shí)難以區(qū)分信號(hào)的難題。這種“光譜正交性”使得研究人員能夠在不相互干擾的情況下，同時(shí)對(duì)神經(jīng)電活動(dòng)（通過GCaMP）和能量代謝（通過R-eLACCO2.1）進(jìn)行觀測，為解析大腦功能提供了前所未有的多維信息。
該傳感器集成了熒光強(qiáng)度與熒光壽命兩種成像模式，極大地增強(qiáng)了其應(yīng)用的靈活性和可靠性。FLIM模式特別適合于活體定量研究，因?yàn)樗苡行Э朔騻鞲衅鞅磉_(dá)量差異、組織光散射和吸收所導(dǎo)致的信號(hào)波動(dòng)，提供更穩(wěn)定、更精確的乳酸濃度讀數(shù)。這種雙模式兼容性使R-eLACCO2.1能夠適應(yīng)從細(xì)胞水平的高通量篩選到活體動(dòng)物深層組織成像的多種實(shí)驗(yàn)場景。
首次在清醒哺乳動(dòng)物中，以細(xì)胞級(jí)分辨率實(shí)時(shí)觀測到了行為刺激和自發(fā)神經(jīng)活動(dòng)所引發(fā)的內(nèi)源性細(xì)胞外乳酸動(dòng)態(tài)變化。特別是發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)活動(dòng)后乳酸可能被快速消耗的瞬時(shí)下降現(xiàn)象，這挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的“神經(jīng)活動(dòng)必然伴隨乳酸產(chǎn)出增加”的簡單認(rèn)知，為重新審視和驗(yàn)證諸如“星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元乳酸穿梭（ANLS）”等經(jīng)典假說提供了強(qiáng)大的新工具。總結(jié)與展望
本研究成功開發(fā)了高性能紅色熒光基因編碼生物傳感器R-eLACCO2.1，實(shí)現(xiàn)了在培養(yǎng)細(xì)胞、腦切片及活體小鼠中對(duì)細(xì)胞外L-乳酸動(dòng)態(tài)的高時(shí)空分辨率、高特異性成像。其紅色熒光特性、優(yōu)異的靈敏度以及對(duì)熒光壽命成像的兼容性，使其成為研究大腦能量代謝與神經(jīng)活動(dòng)之間復(fù)雜關(guān)系的理想工具。利用R-eLACCO2.1，研究團(tuán)隊(duì)在清醒小鼠中揭示了運(yùn)動(dòng)和行為刺激引起的乳酸動(dòng)態(tài)變化，并首次通過雙色成像觀察到神經(jīng)活動(dòng)后細(xì)胞外乳酸的瞬時(shí)消耗，為理解乳酸在大腦中的實(shí)時(shí)功能提供了全新視角。展望未來，R-eLACCO2.1作為一種強(qiáng)大的成像工具，將極大地推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)、代謝生理學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展，特別是在探究阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等與乳酸代謝紊亂相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制方面具有廣闊的應(yīng)用前景。它將繼續(xù)幫助科學(xué)家們描繪乳酸在哺乳動(dòng)物生理與病理過程中所扮演的復(fù)雜而關(guān)鍵的角色。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Kamijo Y, Mächler P, Ness N, Vu CQ, Kusakizako T, Mannuthodikayil J, Ku Z, Boisvert M, Grebenik E, Miyazaki I, Hashizume R, Sato H, Liu R, Hori Y, Tomita T, Katayama T, Furube A, Caraveo G, Paquet ME, Drobizhev M, Nureki O, Arai S, Brancaccio M, Campbell RE, Kleinfeld D, Nasu Y. A red fluorescent genetically encoded biosensor for in vivo imaging of extracellular L-lactate dynamics. Nat Commun. 2025 Oct 29;16(1):9531.
DOI:10.1038/s41467-025-64484-x.
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