構(gòu)建高效、穩(wěn)定的NIR-II磷光以跟蹤活體單細(xì)胞、時間分辨成像

         體內(nèi)光學(xué)成像和分析領(lǐng)域已經(jīng)通過采用近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-1700 nm）波長實現(xiàn)了革命性的變革。由于這一波段的光能顯著減少組織散射，因此能夠?qū)崿F(xiàn)更深層次的組織穿透。這一技術(shù)極大地增強了我們對生命系統(tǒng)實時觀察的能力，能夠以更高的清晰度和分辨率捕捉諸如血流、呼吸、心臟周期以及腎臟清除等動態(tài)生理過程。這些進步的關(guān)鍵在于分子熒光團在NIR-II波段中能夠發(fā)出明亮的光，從而顯著提升了NIR-II光學(xué)成像的性能。盡管取得了顯著進展，但由于內(nèi)源性自身熒光在NIR-II波段的拖尾發(fā)射帶來的背景噪聲，實現(xiàn)高對比度成像依然面臨挑戰(zhàn)。在這種情況下，將長壽命磷光與時間分辨成像技術(shù)相結(jié)合，以增強成像對比度，是一個有希望的解決方案。這是因為組織內(nèi)源性熒光壽命通常較短（小于10納秒）。然而，盡管已有關(guān)于相關(guān)無機納米材料的報道，適合NIR-II波段光學(xué)成像的分子磷光材料的發(fā)展仍然相對有限。

         磷光是一種由三重態(tài)躍遷產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，通常表現(xiàn)為系統(tǒng)間交叉（ISC）效率低，嚴(yán)重的非輻射能量耗散，以及由于自旋禁止過程導(dǎo)致的較慢的發(fā)光速率。較長的壽命和對氧的敏感性使得三重態(tài)激子更容易被氧氣、水和室溫等環(huán)境因素所猝滅。因此，室溫下水溶液中的分子磷光現(xiàn)象極為罕見。目前，用于NIR-II波段的分子磷光材料的開發(fā)仍處于初期階段。這些磷光團的磷光僅能在無水、無氧和低溫（77 K）條件下勉強測量，難以應(yīng)用于生物場景。因此，開發(fā)能夠在室溫水溶液中穩(wěn)定發(fā)光的高質(zhì)量NIR-II分子磷光材料，以實現(xiàn)高質(zhì)量的活體成像，仍然是一個迫切且充滿挑戰(zhàn)的需求。
         為解決上述問題，某大學(xué)教授研究團隊構(gòu)建了一系列基于取代基調(diào)控策略的同色四(異氰基)-銠(I)配合物，其通過親金屬自組裝成寡聚物可以形成明亮和穩(wěn)定的NIR-II分子磷光材料。這些寡聚物具有極高的ISC效率(~98%)和增強的激子耦合長度，兩者協(xié)同導(dǎo)致了寡聚物較高的光致發(fā)光量子產(chǎn)率(PLQY, 0.15-0.98%)。4dσ*(銠)→5pσ(銠)/π*(異氰化物)的三重態(tài)過渡態(tài)導(dǎo)致了寡聚體較長的磷光壽命(7-8 μs)。結(jié)合胎牛血清(FBS)后，組裝蛋白復(fù)合物在生物環(huán)境中顯示出更高的PLQY(0.17-3.93%)和長期穩(wěn)定性。為了證明這一概念，研究人員進行了單巨噬細(xì)胞多路跟蹤和壽命成像，以證明這些高強度和長壽命的NIR-II分子發(fā)光材料在光學(xué)成像中的潛在優(yōu)勢。這項工作不僅為長波長分子磷光的產(chǎn)生提供了一個模型，而且為進一步提高NIR-II成像的對比度提供了一條有希望的途徑。
 
 
圖1.（a）對稱異氰基銠(I)配合物的分子結(jié)構(gòu)。（b）Rh-1A的低溫透射電鏡圖像（c) Rh- 1a納米結(jié)構(gòu)的HAADF掃描TEM圖像以及 x射線能譜元素圖。Rh-1A、Rh-2A和Rh-3A在水溶液(1% DMSO)中的吸收(d)和發(fā)射(e)光譜。（f）Rh-1A、Rh-2A和Rh-3A的發(fā)光衰減曲線，插圖為近紅外相機壽命成像的樣品圖片。Rh-1A、Rh-2A、Rh-3A分別為Rh-1、Rh-2、Rh-3在水溶液中的組合體。
 
 
圖2.（a）Rh-2A/ fbs標(biāo)記巨噬細(xì)胞的NIR-II發(fā)光成像。（b）Rh-2A/FBS(洋紅色)和磷脂包封β-NaErF4@NaYF4(綠色)在808 nm激發(fā)下的歸一化發(fā)射光譜。（c）細(xì)胞追蹤實驗簡化示意圖。（d）血管中Rh-2A/ fbs標(biāo)記巨噬細(xì)胞的雙色成像。（e）急性炎癥小鼠模型簡化示意圖。（f）尾靜脈注射Rh-2A/ fbs標(biāo)記的巨噬細(xì)胞后炎癥區(qū)巨噬細(xì)胞募集的多路成像。（g）LPS誘導(dǎo)的皮膚炎癥(LPS+，藍(lán)色)和健康區(qū)(Ctrl，黃色)成像區(qū)巨噬細(xì)胞數(shù)量對比。
 
 
圖3.（a）含有Rh-3A/FBS的毛細(xì)血管被模擬組織(1%脂肪乳劑)覆蓋前后的發(fā)光強度圖像和壽命圖像。（b）Rh-3A/FBS相對于脂肪乳劑浸泡深度的歸一化強度和壽命。（c，f） 熒光與壽命成像比較模型示意圖。（d，e，g）熒光與壽命成像比較結(jié)果。激發(fā):808 nm。比例尺:5mm。
 
參考文獻(xiàn):
Ben Shi#, Lu Zhang#, Kui Yan, Jiang Ming, Zihan Chen, Ying Chen, Haisheng He, HongxinZhang, Lixin Wang, Shangfeng Wang* and Fan Zhang*, Angew. Chem. Int. Ed., 2024, e202410118.
 
   
         本文利用NIR-II-LT完成了小鼠活體肝臟和胃的熒光壽命成像實驗。NIR-II-LT是一款長熒光壽命（微秒-毫秒）成像的近紅外二區(qū)系統(tǒng)，用于表征體內(nèi)或體外探針的熒光壽命信息。搭載深度制冷的InGaAs近紅外相機能夠滿足長時間曝光成像，尤其對于弱光能有很高的采集效率。自主開發(fā)的熒光壽命成像軟件功能一鍵操作，可方便的實現(xiàn)樣品信號采集、參數(shù)調(diào)節(jié)、熒光壽命擬合等一系列操作，獲得最終熒光壽命數(shù)據(jù)。成像視野2 cm×2 cm。除此之外，系統(tǒng)仍然具有寬場熒光成像功能，可利用軟件電動切換成像模式。系統(tǒng)配有三維平移臺（集合了自動加熱裝置），選配激光器、X射線、近紅外LED等等。該NIR-II-LT可應(yīng)用于活體內(nèi)多組分定量分析、活體內(nèi)免疫組化分析、活體細(xì)胞標(biāo)記以及活體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的定量傳感分析，實現(xiàn)熒光強度成像無法實現(xiàn)的深組織定量分析等。
   
         文中巨噬細(xì)胞活體追蹤及多色成像實驗均采用近紅外二區(qū)顯微成像系統(tǒng)M-NIR-II進行的。該M-NR-II系統(tǒng)相機性能優(yōu)異，具有三種深度制冷的InGaAs近紅外相機可供用戶自由選擇。配備多款不同倍數(shù)的物鏡，能夠?qū)崿F(xiàn)多種微區(qū)視野高信噪比活體成像�？蛇x配多重波長激光器、X射線、近紅外LED等多種激發(fā)光源。可搭配多個相機，動態(tài)實時示蹤活體多種不同標(biāo)記物。自主開發(fā)的軟件功能一鍵操作，可實現(xiàn)圖像采集與處理一體化，圖像處理功能強大，終身免費升級。該系統(tǒng)可應(yīng)用于腫瘤局部成像、微血管造影、細(xì)胞染色實驗、活體細(xì)胞示蹤、免疫細(xì)胞互作機理研究、癌細(xì)胞遷移以及病理切片分析等。