氧化應(yīng)激研究中NRF2的翻譯后修飾及條帶位置的爭(zhēng)議
氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）由于活性氧（自由基）的產(chǎn)生和抗氧化防御之間的平衡紊亂，引起的組織損傷，可導(dǎo)致多種疾病，比如神經(jīng)系統(tǒng)（帕金森病、阿爾茨海默�。⑿难芗膊。ǜ吣懝檀佳Y和動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、心肌梗塞等）、生殖系統(tǒng)疾病或自身免疫疾病等。
NRF2是在OS反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。在穩(wěn)態(tài)條件下，KEAP1結(jié)合 NRF2，并將其保留在細(xì)胞漿內(nèi)，進(jìn)行泛素介導(dǎo)的降解，維持較低NRF2水平。少量組成型胞核 NRF2 通過調(diào)節(jié)抗氧化劑反應(yīng)基因的基礎(chǔ)表達(dá)來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在OS后，KEAP1 釋放 NRF2，從而使激活劑轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件ARE 元件基因結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，比如GSH、HO-1、NADP(H)、NQO1等。
圖1 Nrf2與炎癥通路的調(diào)控（R. Wang，2020）
目前研究氧化應(yīng)激的老師很多，NRF2鑒于它的特殊性，是一個(gè)比較難檢測(cè)的指標(biāo)。那么在檢測(cè)NRF2前我們需要了解哪些信息呢？小優(yōu)整理了如下三點(diǎn)：
01 WB檢測(cè)限-細(xì)胞中較高的蛋白水平
從HPA（The Human protein Atlas）可知NRF2的在各組織中的基因表達(dá)水平尚可，但在穩(wěn)態(tài)下NRF2的實(shí)際蛋白水平是很低的，不斷地經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑被降解。
圖2 NRF2在人源細(xì)胞系中的基因表達(dá)水平（HPA）
圖3泛素-蛋白酶體途徑
需要氧化應(yīng)激/親電子試劑（如圖4上，亞砷酸鹽50 μM，8 h,）處理導(dǎo)致(KEAP1) E3 泛素連接酶復(fù)合物失活，或者蛋白酶體抑制劑（如圖4下，MG132 10 μM，10 h）處理令其不被降解。
圖4 不同處理NRF2的蛋白表達(dá)情況（CST）
02 翻譯后修飾
根據(jù)Uniport可查到NRF2有多個(gè)翻譯后修飾 (PTM)。其中磷酸化Ser40和乙�；龠M(jìn)其核定位，并易位到核內(nèi)。糖基化阻止了小 Maf 蛋白的異二聚化，從而削弱轉(zhuǎn)錄因子活性。入核后，通過FN3K的去糖作用恢復(fù)活性，與Maf形成異二聚體，結(jié)合ARE發(fā)揮作用。
03 NRF2條帶位置的爭(zhēng)議
由于抗體生產(chǎn)方面的原因，一直以來許多研究者認(rèn)為Nrf2是以預(yù)測(cè)的55-65 kDa 的分子量遷移，該預(yù)測(cè)是根據(jù) Nrf2 的開放閱讀框大小 2.2-kb 做出的。Alexandria Lau在2013年通過化學(xué)刺激、哺乳動(dòng)物過表達(dá)和重組蛋白表達(dá)提供了證據(jù)，證明NRF2實(shí)際條帶應(yīng)該在95-110KD。此后各抗體供應(yīng)商們也糾正了這個(gè)錯(cuò)誤，目前標(biāo)注的實(shí)際條帶位置都在95-110KD。
圖6 Nrf2條帶位置的驗(yàn)證
在后續(xù)具體的WB實(shí)驗(yàn)中，我們可能會(huì)遇到無條帶、非特異帶、高背景或者條帶位置不對(duì)的情況。小優(yōu)細(xì)節(jié)君根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)也整理出了一套解決方案。
a、無條帶：
可能原因：樣品未經(jīng)合適處理；降解或提取不充分；抗體不工作
b、非特異帶：
可能原因：樣品降解；同型或者修飾；多聚體；漂洗不充分；抗體非特異
c、高背景：
可能原因：樣品降解；試劑或操作污染；漂洗不充分；PVDF膜；抗體非特異
d、條帶位置不對(duì)：
可能原因：樣品降解，膠濃度，抗體非特異
解決方案
a、設(shè)置陽性對(duì)照，選擇合適的處理(MG132，氧化應(yīng)激)作為陽性樣品；樣品新鮮制備；被Keap1釋放后入核，裂解時(shí)強(qiáng)烈建議超聲處理，或者用專門的核提取試劑盒；增加上樣量(細(xì)胞20μg，組織50-100μg)；更換抗體。
b、新鮮制備樣品；同型/修飾換其他細(xì)胞樣品看看；存在異源二聚體，因此loading buffer中還原劑（0.6MDTT或者5%B-ME）要有效，可另外添加；加強(qiáng)漂洗，增加漂洗液中的NaCl 濃度（150mM-500mM）和Tween濃度（0.1-0.5%）；更換抗體。
c、新鮮制備樣品；實(shí)驗(yàn)中試劑包括電泳液、轉(zhuǎn)膜液、漂洗液、脫脂奶粉、抗體稀釋液等用新鮮配制的，海綿也要洗干凈，濾紙換新的，操作時(shí)用鑷子夾邊緣不要用手觸摸，孵育時(shí)放平，不要彎曲導(dǎo)致孵育不均，膜干掉；加強(qiáng)漂洗，增加漂洗液中的NaCl和Tween濃度；使用NC膜背景會(huì)相對(duì)低點(diǎn)；更換抗體。
d、新鮮制備樣品；使用梯度膠，排查問題時(shí)孵全膜；更換抗體。
參考資料
1.Molecular Mechanisms of Nrf2 in Inflammation: Interactions Between Nrf2 and Inflammatory Mediators
2.The Predicted Molecular Weight of Nrf2: It Is What It Is Not
3.https://www.uniprot.org/uniprot/Q16236
4.https://www.proteinatlas.org/ENSG00000116044-NFE2L2/celltype
NRF2是在OS反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。在穩(wěn)態(tài)條件下，KEAP1結(jié)合 NRF2，并將其保留在細(xì)胞漿內(nèi)，進(jìn)行泛素介導(dǎo)的降解，維持較低NRF2水平。少量組成型胞核 NRF2 通過調(diào)節(jié)抗氧化劑反應(yīng)基因的基礎(chǔ)表達(dá)來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在OS后，KEAP1 釋放 NRF2，從而使激活劑轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件ARE 元件基因結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，比如GSH、HO-1、NADP(H)、NQO1等。
圖1 Nrf2與炎癥通路的調(diào)控（R. Wang，2020）
目前研究氧化應(yīng)激的老師很多，NRF2鑒于它的特殊性，是一個(gè)比較難檢測(cè)的指標(biāo)。那么在檢測(cè)NRF2前我們需要了解哪些信息呢？小優(yōu)整理了如下三點(diǎn)：
01 WB檢測(cè)限-細(xì)胞中較高的蛋白水平
從HPA（The Human protein Atlas）可知NRF2的在各組織中的基因表達(dá)水平尚可，但在穩(wěn)態(tài)下NRF2的實(shí)際蛋白水平是很低的，不斷地經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑被降解。
圖2 NRF2在人源細(xì)胞系中的基因表達(dá)水平（HPA）
圖3泛素-蛋白酶體途徑
需要氧化應(yīng)激/親電子試劑（如圖4上，亞砷酸鹽50 μM，8 h,）處理導(dǎo)致(KEAP1) E3 泛素連接酶復(fù)合物失活，或者蛋白酶體抑制劑（如圖4下，MG132 10 μM，10 h）處理令其不被降解。
圖4 不同處理NRF2的蛋白表達(dá)情況（CST）
02 翻譯后修飾
根據(jù)Uniport可查到NRF2有多個(gè)翻譯后修飾 (PTM)。其中磷酸化Ser40和乙�；龠M(jìn)其核定位，并易位到核內(nèi)。糖基化阻止了小 Maf 蛋白的異二聚化，從而削弱轉(zhuǎn)錄因子活性。入核后，通過FN3K的去糖作用恢復(fù)活性，與Maf形成異二聚體，結(jié)合ARE發(fā)揮作用。
圖5 NRF2的幾種修飾和異二聚體的形成
03 NRF2條帶位置的爭(zhēng)議
由于抗體生產(chǎn)方面的原因，一直以來許多研究者認(rèn)為Nrf2是以預(yù)測(cè)的55-65 kDa 的分子量遷移，該預(yù)測(cè)是根據(jù) Nrf2 的開放閱讀框大小 2.2-kb 做出的。Alexandria Lau在2013年通過化學(xué)刺激、哺乳動(dòng)物過表達(dá)和重組蛋白表達(dá)提供了證據(jù)，證明NRF2實(shí)際條帶應(yīng)該在95-110KD。此后各抗體供應(yīng)商們也糾正了這個(gè)錯(cuò)誤，目前標(biāo)注的實(shí)際條帶位置都在95-110KD。
圖6 Nrf2條帶位置的驗(yàn)證
在后續(xù)具體的WB實(shí)驗(yàn)中，我們可能會(huì)遇到無條帶、非特異帶、高背景或者條帶位置不對(duì)的情況。小優(yōu)細(xì)節(jié)君根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)也整理出了一套解決方案。
a、無條帶：
可能原因：樣品未經(jīng)合適處理；降解或提取不充分；抗體不工作
可能原因：樣品降解；同型或者修飾；多聚體；漂洗不充分；抗體非特異
可能原因：樣品降解；試劑或操作污染；漂洗不充分；PVDF膜；抗體非特異
可能原因：樣品降解，膠濃度，抗體非特異
解決方案
a、設(shè)置陽性對(duì)照，選擇合適的處理(MG132，氧化應(yīng)激)作為陽性樣品；樣品新鮮制備；被Keap1釋放后入核，裂解時(shí)強(qiáng)烈建議超聲處理，或者用專門的核提取試劑盒；增加上樣量(細(xì)胞20μg，組織50-100μg)；更換抗體。
b、新鮮制備樣品；同型/修飾換其他細(xì)胞樣品看看；存在異源二聚體，因此loading buffer中還原劑（0.6MDTT或者5%B-ME）要有效，可另外添加；加強(qiáng)漂洗，增加漂洗液中的NaCl 濃度（150mM-500mM）和Tween濃度（0.1-0.5%）；更換抗體。
c、新鮮制備樣品；實(shí)驗(yàn)中試劑包括電泳液、轉(zhuǎn)膜液、漂洗液、脫脂奶粉、抗體稀釋液等用新鮮配制的，海綿也要洗干凈，濾紙換新的，操作時(shí)用鑷子夾邊緣不要用手觸摸，孵育時(shí)放平，不要彎曲導(dǎo)致孵育不均，膜干掉；加強(qiáng)漂洗，增加漂洗液中的NaCl和Tween濃度；使用NC膜背景會(huì)相對(duì)低點(diǎn)；更換抗體。
d、新鮮制備樣品；使用梯度膠，排查問題時(shí)孵全膜；更換抗體。
參考資料
1.Molecular Mechanisms of Nrf2 in Inflammation: Interactions Between Nrf2 and Inflammatory Mediators
2.The Predicted Molecular Weight of Nrf2: It Is What It Is Not
3.https://www.uniprot.org/uniprot/Q16236
4.https://www.proteinatlas.org/ENSG00000116044-NFE2L2/celltype
標(biāo)簽：
氧化應(yīng)激
NRF2
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