蛋白酶抑制劑Cocktail等助力揭示SLC7A11如何加速帕金森病理和鐵死亡

溶酶體作為細胞的"消化中心"，腔內(nèi)的 酸性環(huán)境（pH 4.5-5.0）是維持其降解功能的核心條件。目前已知約有60多種水解酶的最適pH分布在此范圍，過酸或過堿都會顯著抑制水解酶功能導致底物累積和自噬通量受損。維持這一酸性范圍依賴于兩個關(guān)鍵過程：V-ATPase 介導的 H+主動泵入和 H+泄漏途徑。

近期，浙江大學良渚實驗室徐浩新團隊新鑒定了一種非經(jīng)典的溶酶體H+泄露途徑的分子基礎(chǔ)——SLC7A11，并揭示了此通路參與溶酶體和細胞功能調(diào)控的機制，以及其在神經(jīng)退行性疾病的病理進程的關(guān)鍵作用。相關(guān)內(nèi)容已以 SLC7A11 is an unconventional H+ transporter in lysosomes 為題發(fā)表于 Cell 期刊。研究還使用了TargetMol的蛋白酶抑制劑 Cocktail（C0001）以及CCK-8（C0005）噢~ 大佬的選擇，你值得擁有！

SLC7A11蛋白的新功能
該團隊此前已發(fā)現(xiàn) TMEM175（團隊命名Lyso-H1）介導的溶酶體快速H+釋放途徑（Cell, 2022）在溶酶體過酸時（pH < 4.5）被激活，從而避免水解酶活性被抑制。

在最新研究中，他們發(fā)現(xiàn)使用巴弗霉素A1（Baf A1）抑制 V-ATPase 后，野生型（WT）和TMEM175敲除（KO）細胞系（HeLa和HAP1）的溶酶體酸性顯著降低。這些結(jié)果表明，可能存在不止一種H+泄漏途徑來調(diào)控溶酶體 pH（LysoH2）。

隨后，研究者基于大量公開發(fā)表的溶酶體蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)構(gòu)建孤兒溶酶體膜蛋白（OLMP）KO 細胞文庫并進行篩選。發(fā)現(xiàn)在 OLMP KO 細胞系中，僅 SLC7A11 KO 細胞（HeLa和HAP1）的溶酶體 在 V-ATPase 抑制30分鐘后與WT細胞溶酶體相比仍顯著酸化。

同時，通過小分子化合物庫高通量篩選找到了對溶酶體酸性有顯著調(diào)控作用的分子——Erastin（常用鐵死亡誘導劑，也是SLC7A11抑制劑）。由此確定了SLC7A11是 LysoH2 通路的關(guān)鍵分子介質(zhì)。

▲基于OLMP敲除細胞文庫和小分子化合物庫的高通量篩選編碼LysoH2的基因

SLC7A11通過胱氨酸和Glu通量介導溶酶體H+泄漏
溶質(zhì)載體家族成員SLC7A11（Solute Carrier Family 7 Member 11）是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運第7家族的第11個成員，屬于胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白，主要參與氨基酸在質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運，而本研究發(fā)現(xiàn)它也定位于溶酶體，通過順濃度梯度排出胱氨酸（Cys2）和攝入谷氨酸（Glu）發(fā)揮其質(zhì)子流出/酸性調(diào)節(jié)功能。具體表現(xiàn)如下：

• SLC7A11 缺失導致溶酶體內(nèi) Cys2 水平升高。
• 使用 cysteamine 耗竭溶酶體 Cys2 會減弱 V-ATPase 抑制劑誘導的去酸性化。
• 在體外分離的溶酶體中，加入細胞質(zhì)側(cè)的 Glu 會導致 WT 溶酶體去酸性化，此效應可被 SLC7A11 抑制劑阻斷，且在 SLC7A11 KO 溶酶體中不發(fā)生。
• 增加腔內(nèi) Cys2 濃度（通過 Cys2-AM）也能促進去酸性化。
• SLC7A11 的轉(zhuǎn)運活性位點突變（K198A）或影響其溶酶體定位的突變（AAS）會消除其對溶酶體酸性的調(diào)節(jié)作用。

▲SLC7A11通過順濃度梯度轉(zhuǎn)運Cys2/Glu介導溶酶體H+泄漏

溶酶體 pH在抗鐵死亡中發(fā)揮作用
維持最佳的溶酶體 pH 對細胞抵抗鐵死亡至關(guān)重要。研究人員發(fā)現(xiàn)，在多種細胞中，erastin 誘導的溶酶體過度酸化會導致明顯的細胞死亡，而低劑量氯喹（CQ）、尼可沙胺（Nilocide）或 IMD-0354 的處理可通過 恢復溶酶體 pH 來發(fā)揮抗鐵死亡作用。

與此相對，RSL3誘導的鐵死亡對溶酶體 pH 干預不敏感，提示鐵死亡的關(guān)鍵步驟在于溶酶體H+泄漏對脂質(zhì)過氧化的抑制作用，而非單純依賴 GSH 恢復。

進一步研究顯示，TMEM175 與 SLC7A11 共同參與溶酶體 pH 調(diào)控，但僅 SLC7A11 缺失會觸發(fā)鐵死亡，其機制可能涉及溶酶體胱氨酸/谷氨酸交換及酸堿穩(wěn)態(tài)失衡。在原本對 erastin 不敏感的細胞（如 HeLa、成纖維細胞）中，胱氨酸饑餓或 SLC7A11 上調(diào)會使其易感于 SLC7A11 依賴的鐵死亡，這一效應同樣可通過 CQ 治療逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明，SLC7A11 在溶酶體水平上發(fā)揮核心抗鐵死亡作用，維持溶酶體酸堿穩(wěn)態(tài)是其防止脂質(zhì)過氧化與細胞死亡的關(guān)鍵機制。

此外，SLC7A11 還通過調(diào)控溶酶體的酸性環(huán)境，影響 α-突觸核蛋白的聚集，這在帕金森病的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。

▲SLC7A11敲除小鼠腦中病理性α突觸核蛋白的加速積累及帕金森癥行為學表型（上）低劑量氯喹（CQ 1 μM）修正溶酶體pH成功逆轉(zhuǎn)細胞鐵死亡（下）

小結(jié)
綜上，該研究揭示了 SLC7A11 介導的溶酶體慢速H+泄漏途徑，結(jié)合該團隊此前發(fā)現(xiàn)的TMEM175介導的溶酶體快速H+釋放途徑（Cell, 2022），與V-ATPase形成了溶酶體酸堿平衡調(diào)控的邏輯閉環(huán)，解答了該領(lǐng)域近50年懸而未決的問題。