雙光子-光聲顯微鏡同步實(shí)現(xiàn)微血管140μm與神經(jīng)元>300μm深層成像

重要發(fā)現(xiàn)
01核心貢獻(xiàn)：高速、大體積活體深組織三維成像
本研究的核心貢獻(xiàn)在于創(chuàng)造性地將雙光子激發(fā)（2PE）技術(shù)與光片照明（Light-sheetillumination）相結(jié)合，構(gòu)建了一種新型顯微鏡系統(tǒng)——雙光子光片顯微鏡（2P-LSM）。這一技術(shù)突破性地解決了在活體組織中，特別是在大腦皮層下深層區(qū)域，進(jìn)行高速、大范圍三維成像的難題。傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡受限于點(diǎn)掃描方式，成像速度慢且光毒性高；而傳統(tǒng)單光子光片顯微鏡則難以穿透深層組織。2P-LSM則兼具了雙光子激發(fā)的深層穿透、光學(xué)層析能力和光片照明的高速、低光毒性優(yōu)勢(shì)。

02關(guān)鍵光學(xué)技術(shù)與成像過(guò)程
雙光子激發(fā)（2PE）原理應(yīng)用：系統(tǒng)利用近紅外飛秒脈沖激光作為激發(fā)光源。雙光子激發(fā)過(guò)程要求熒光分子同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）光子，達(dá)到激發(fā)態(tài)。

這帶來(lái)了顯著優(yōu)勢(shì)：激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)（通常在~1000-1300nm范圍），散射更少，穿透深度顯著增加；激發(fā)只發(fā)生在物鏡焦平面附近一個(gè)極小的體積內(nèi)（光學(xué)層析），有效抑制了背景噪聲，提升了成像信噪比（SNR）和對(duì)比度；同時(shí)，長(zhǎng)波長(zhǎng)光子能量較低，對(duì)生物樣本的光損傷和光漂白效應(yīng)大大降低。

光片照明（Light-sheetillumination）實(shí)現(xiàn)：與傳統(tǒng)的點(diǎn)掃描2PE顯微鏡不同，本研究創(chuàng)新性地將激發(fā)光整形為一片薄而寬的光片。這片光片被側(cè)向投射到樣本中，僅照亮需要成像的焦平面。照明方式從點(diǎn)掃描變?yōu)槊嬲彰�，這是實(shí)現(xiàn)高速成像的關(guān)鍵。

高速三維成像流程：
光片生成與投射：近紅外飛秒激光經(jīng)過(guò)光束整形光學(xué)元件（如柱面鏡組）形成薄光片。
樣本照明：該光片從側(cè)面入射，照亮樣本內(nèi)部一個(gè)特定的焦平面（XY平面）。
熒光信號(hào)收集：位于照明光路垂直方向的另一套高數(shù)值孔徑（NA）物鏡收集被光片激發(fā)的樣本自發(fā)熒光或標(biāo)記熒光信號(hào)。
面探測(cè)：收集的熒光信號(hào)被傳輸?shù)礁咚�、高靈敏度的相機(jī)（如sCMOS相機(jī)）進(jìn)行探測(cè)。相機(jī)一次曝光即可獲取整個(gè)照明焦平面（一個(gè)光學(xué)切片）的圖像，速度遠(yuǎn)快于點(diǎn)掃描。
三維層析：通過(guò)精密地沿Z軸（深度方向）移動(dòng)樣本或物鏡，使光片依次照亮相鄰的不同焦平面。對(duì)每個(gè)焦平面進(jìn)行高速面探測(cè)成像，最終將這些二維切片圖像組合起來(lái)，即可重構(gòu)出樣本的三維結(jié)構(gòu)。
動(dòng)態(tài)觀測(cè)：快速重復(fù)上述三維成像過(guò)程，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)活體樣本內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程（如血流、鈣信號(hào)）的高速三維電影拍攝。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論明確：雙光子光片顯微鏡（2P-LSM）是一種強(qiáng)大的活體三維成像工具，它成功結(jié)合了雙光子激發(fā)的深層穿透、光學(xué)層析能力和光片照明的高速、低光毒性優(yōu)勢(shì)，首次實(shí)現(xiàn)了在活體哺乳動(dòng)物大腦皮層下深層區(qū)域進(jìn)行高速（Hz級(jí)體積速率）、大范圍（百微米級(jí)體積）、高分辨率（亞細(xì)胞水平）的三維動(dòng)態(tài)成像，為神經(jīng)科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究開(kāi)辟了新視野。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破核心難題
本研究的首要亮點(diǎn)在于成功突破了活體深組織高速三維動(dòng)態(tài)成像的長(zhǎng)期瓶頸。在活體組織中，尤其是哺乳動(dòng)物大腦內(nèi)部，強(qiáng)烈的光散射嚴(yán)重限制了光學(xué)成像的深度和分辨率；高速成像需求與低光毒性以避免損傷活體樣本之間存在矛盾；傳統(tǒng)點(diǎn)掃描方式速度慢，難以捕捉快速生理過(guò)程。2P-LSM通過(guò)融合雙光子激發(fā)和光片照明，巧妙地解決了這一系列相互制約的難題：近紅外雙光子激發(fā)穿透更深、背景更低；光片照明實(shí)現(xiàn)高速面探測(cè)；兩者結(jié)合顯著降低了單位像素的光劑量，減輕了光損傷。

04廣泛的應(yīng)用價(jià)值
這項(xiàng)技術(shù)的價(jià)值遠(yuǎn)不止于神經(jīng)科學(xué)。它為解決生物醫(yī)學(xué)研究中需要在活體、深層組織內(nèi)進(jìn)行高速、高分辨率三維觀測(cè)的難題提供了通用平臺(tái)：
神經(jīng)科學(xué)：深入研究皮層下核團(tuán)（如丘腦、下丘腦、基底節(jié)）在感覺(jué)處理、運(yùn)動(dòng)控制、睡眠覺(jué)醒、情緒記憶等高級(jí)功能中的作用，解析深部神經(jīng)回路動(dòng)態(tài)。
血管生物學(xué)：在體定量研究深層微循環(huán)的血流動(dòng)力學(xué)、血管調(diào)節(jié)、血管新生以及血腦屏障功能。
免疫學(xué)：實(shí)時(shí)觀察免疫細(xì)胞（如小膠質(zhì)細(xì)胞、外周浸潤(rùn)免疫細(xì)胞）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)深層區(qū)域的巡邏、激活和相互作用。
腫瘤研究：監(jiān)測(cè)深層腫瘤微環(huán)境中的血管生成、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、腫瘤細(xì)胞遷移和藥物輸送過(guò)程。
發(fā)育生物學(xué)：追蹤胚胎或器官發(fā)育過(guò)程中深層組織的細(xì)胞行為和組織形態(tài)發(fā)生。

總結(jié)與展望
本研究成功開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了雙光子光片顯微鏡（2P-LSM），這一創(chuàng)新技術(shù)將雙光子激發(fā)的深層穿透、光學(xué)層析能力與光片照明的高速、低光毒性優(yōu)勢(shì)完美融合，首次實(shí)現(xiàn)了在活體哺乳動(dòng)物大腦皮層下深層區(qū)域（>600μm）進(jìn)行高速（Hz級(jí)體積速率）、大范圍（百微米級(jí)體積）、高分辨率（亞細(xì)胞水平）的三維動(dòng)態(tài)成像。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)成像方法在深度、速度和光損傷方面的限制，為清晰揭示活體深部組織（如丘腦、下丘腦）中神經(jīng)元活動(dòng)、血管網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)和免疫細(xì)胞行為等關(guān)鍵生理過(guò)程提供了前所未有的強(qiáng)大工具，極大地推動(dòng)了神經(jīng)科學(xué)、血管生物學(xué)及相關(guān)疾病研究的進(jìn)展。

展望未來(lái)，該技術(shù)仍有優(yōu)化空間，例如通過(guò)自適應(yīng)光學(xué)進(jìn)一步校正組織像差以提升更深層的成像質(zhì)量，開(kāi)發(fā)多色甚至多光子版本以同時(shí)觀測(cè)更多生物指標(biāo)，結(jié)合行為學(xué)裝置研究自由活動(dòng)動(dòng)物，以及探索在其它器官（如心臟、腎臟、腫瘤）深部成像的應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷成熟和應(yīng)用范圍的拓展，雙光子光片顯微鏡有望成為生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的利器，持續(xù)為理解復(fù)雜生命系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)奧秘提供關(guān)鍵洞察。

DOI:10.1038/s41598-025-07819-4.