在離子通道研究中，理解電壓門控鈉（Nav）和鉀（Kv）通道的作用機制至關(guān)重要，描述這些通道在組織內(nèi)的分布通常需借助抗體進行免疫組化或免疫熒光。然而，抗體是一種相對較大的蛋白，與其結(jié)合可能影響離子通道的功能1,2。此外，使用抗體時通常需要對樣本進行固定處理，導致無法動態(tài)檢測活細胞的狀態(tài)。
為應對以上挑戰(zhàn)，Alomone Labs開發(fā)了一種新型膜蛋白標記工具——熒光標記毒素。該技術(shù)將一系列多肽類毒素（如蝎毒、蛇毒等）與熒光探針（如ATTO-Fluor或FITC）偶聯(lián)，所得熒光標記毒素能夠與目的蛋白特異性結(jié)合，且具備顯著優(yōu)勢：
● 特異性強：精準靶向目標蛋白（如GABA(A) 受體, nAChRs，電壓門控鉀通道KV等），能夠區(qū)分高度相似的通道亞型
● 高親和力：具有皮摩爾/納摩爾級親和力
● 兼容活細胞樣本：無需固定樣本，可直接用于活組織，觀察真實生理狀態(tài)
● 功能調(diào)控潛力：能夠以多種方式調(diào)節(jié)通道功能
相比大分子抗體，熒光標記毒素避免了固定樣本的需求和潛在的干擾問題，能更出色地描繪通道分布。
研究者們已巧妙應用此類工具：科學家構(gòu)建了熒光蛋白-Kv通道蝎毒素嵌合體，展示了標記毒素的強大應用3，其他研究則利用Cy5標記的蛤蚌毒素（麻痹性貝類毒素）4，或Alexa染料標記的蝎毒素（如釹蝎毒 TsTX、毒素-γ TiTX-g）5來研究Naᵥ通道。毒素與離子通道的相互作用持續(xù)受到關(guān)注6，預示著更多創(chuàng)新性標記毒素工具的開發(fā)和應用。
熒光毒素成像：解鎖離子通道定位
利用熒光探針標記毒素，可生成既精美又蘊含豐富信息量的圖像，能夠大幅拓展進行多重檢測的可能性。若與抗體結(jié)合使用，有望獲取更詳盡的數(shù)據(jù)集。
MmTx1 Toxin-ATTO Fluor-488標記大鼠小腦GABA(A) α1受體。
將大鼠腦切片與25 nM濃度MmTx1 Toxin-ATTO Fluor-488（#STM-550-AG）一起孵育。然后，將這些切片依次與抗GABA(A) α1受體（細胞外）抗體（#AGA-001）和Cy3（紅色）標記驢抗兔抗體一起孵育。A：顆粒層（GL）（箭頭）內(nèi)的斑塊中出現(xiàn)MmTx1 Toxin-ATTO Fluor-488結(jié)合現(xiàn)象（綠色）。B：GL神經(jīng)元（箭頭）的圖譜中出現(xiàn)GABA(A) α1受體免疫染色現(xiàn)象。C：合并兩幅圖像后，顯示不同程度的共定位現(xiàn)象。DAPI用作復染劑。
使用Tertiapin-Q-ATTO Fluor-488和豚鼠抗GIRK2(Kir3.2)抗體對黑質(zhì)致密部中的GIRK2通道進行多重染色。
首先，將大鼠腦切片與33 nM Tertiapin-Q-ATTO Fluor-488（#STT-170-AG）（綠色）一起孵育。將這些切片與豚鼠抗GIRK2 (Kir3.2) 抗體（#AGP-013）一起孵育。A：黑質(zhì)致密部（SNC）神經(jīng)元（箭頭）的圖譜中出現(xiàn)Tertiapin-Q-ATTO Fluor-488結(jié)合現(xiàn)象。B：在SNC神經(jīng)元（箭頭）的圖譜中檢測到GIRK2染色現(xiàn)象（紅色）。C：合并兩幅圖像后，顯示Tertiapin-Q-ATTO Fluor-488和豚鼠抗GIRK2 (Kir3.2) 抗體對GIRK2通道的共染色。DAPI染色劑（藍色）用于對細胞核染色。
Tityustoxin-Kα-ATTO Fluor-594標記小鼠小腦中的KV1.2通道。
A：使用Tityustoxin-Kα-ATTO Fluor-594（#STT-360-AR）（紅色）對自由漂浮的小鼠腦切片進行多重染色。然后，依次使用抗Kv1.2 (KCNA2) 抗體（#APC-010）（1:200）和山羊抗兔抗體-AlexaFluor-488（綠色）對切片進行染色。在小腦的籃狀結(jié)構(gòu)（黃色染色，箭頭）中同時檢出Tityustoxin-Kα-ATTO Fluor-594和KV1.2。B：依次使用Tityustoxin-Kα-ATTO Fluor-594（紅色）和細小清蛋白抗體標記相同腦切片。Tityustoxin-Kα-ATTO Fluor-594（紅色）標記小腦的籃狀結(jié)構(gòu)（箭頭）。細小清蛋白不僅將籃狀結(jié)構(gòu)染色，還將浦肯野細胞體染色。二者之間的共定位以黃色表示。
相關(guān)可用的熒光毒素：
一、GABA(A) 受體（GABA(A) Receptors）
1.α-Bungarotoxin-ATTO Fluor-488（貨號B-100-AG）
結(jié)合靶標：α7, α1/β1/γ/δ nAChR and GABA(A) receptor subtypes
已發(fā)表文獻：11篇
2.α-Bungarotoxin-ATTO Fluor-633（貨號B-100-FR）
結(jié)合靶標：α7, α1/β1/γ/δ nAChR and GABA(A) receptor subtypes
已發(fā)表文獻：1篇
結(jié)合靶標：α7, α1/β1/γ/δ nAChR and GABA(A) receptor subtypes
已發(fā)表文獻：1篇
結(jié)合靶標：GABA(A) receptors
二、電壓門控鉀通道（Voltage-Gated K+ Channels, Kv）
1.Agitoxin-2-Cys-TAMRA（貨號RTA-420-T）
結(jié)合靶標：KV1.3 K+ channels
已發(fā)表文獻：5篇
2.Tityustoxin-Kα-ATTO Fluor-594（貨號STT-360-AR）
結(jié)合靶標：KV1.2 K+ channels
已發(fā)表文獻：1篇
3.Stichodactyla Toxin-ATTO Fluor-590（貨號STS-400-AR）
結(jié)合靶標：KV1.1, KV1.3, KV1.4, KV1.6 channels
三、內(nèi)向整流型鉀離子通道（Inward Rectifier K+ Channels, Kir）
結(jié)合靶標：Kir1.1, Kir3.2 K+ channels
結(jié)合靶標：Kir1.1, Kir3.2 K+ channels
四、煙堿乙酰膽堿受體（Nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs）
1.α-Bungarotoxin-ATTO Fluor-488（貨號B-100-AG）
結(jié)合靶標：α7, α1/β1/γ/δ nAChR and GABA(A) receptor subtypes
已發(fā)表文獻：11篇
2.α-Bungarotoxin-ATTO Fluor-633（貨號B-100-FR）
結(jié)合靶標：α7, α1/β1/γ/δ nAChR and GABA(A) receptor subtypes
已發(fā)表文獻：1篇
結(jié)合靶標：α7, α1/β1/γ/δ nAChR and GABA(A) receptor subtypes
已發(fā)表文獻：1篇
4.α-Conotoxin ImI-ATTO Fluor-590（貨號C-290-AR）
結(jié)合靶標：α3/β2 nAChR
參考文獻
1. Schofield, G. G., Puhl, H. L. & Ikeda, S. R. Properties of wild-type and fluorescent protein-tagged mouse tetrodotoxin-resistant sodium channel (NaV1.8) heterologously expressed in rat sympathetic neurons. J. Neurophysiol. 99, (2008).
2. Maue, R. A. Understanding ion channel biology using epitope tags: Progress, pitfalls, and promise. Journal of Cellular Physiology vol. 213 (2007).
3. Kuzmenkov, A. I. et al. Fluorescent protein-scorpion toxin chimera is a convenient molecular tool for studies of potassium channels. Sci. Rep. 6, 1–10 (2016).
4. Ondrus, A. E. et al. Fluorescent saxitoxins for live cell imaging of single voltage-gated sodium ion channels beyond the optical diffraction limit. Chem. Biol. 19, 902–912 (2012).
5. Massensini, A. R. et al. Tracking sodium channels in live cells: Confocal imaging using fluorescently labeled toxins. J. Neurosci. Methods 116, 189–196 (2002).
6. Jiang, D. et al. Structural basis for voltage-sensor trapping of the cardiac sodium channel by a deathstalker scorpion toxin. Nat. Commun. 12, (2021).
