聚集小體的生物學作用及檢測方法

1. 聚集小體的生物學作用是什么？

聚集小體是泛素-蛋白酶體機制被錯誤折疊和聚集的蛋白質(zhì)壓垮時形成的包涵體。通常情況下，聚集小體的出現(xiàn)往往也表明細胞正處于某種應(yīng)激狀態(tài)，比如高溫、病毒感染、活性氧自由基攻擊等。聚集小體或類聚集小體包涵體能封存有毒的聚集蛋白，從而起到保護細胞的作用。聚集小體的形成還有助于通過自噬-溶酶體途徑降解聚集蛋白。分子伴侶和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解折疊錯誤的蛋白質(zhì)等平衡機制有助于防止蛋白質(zhì)聚集小體的形成。

2. 為什么必須測量細胞中的聚集小體？

聚集小體在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要作用。過度磷酸化的 tau 蛋白聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，β-淀粉樣蛋白聚集形成淀粉樣蛋白斑塊，它們都與阿爾茨海默癥有關(guān)。路易體（Lewy）主要由聚集的泛素和α-突觸核蛋白組成，常見于帕金森病患者的神經(jīng)元中。馬洛里小體（Mallory）與酒精性肝病患者的肝細胞有關(guān)。在亨廷頓病中，亨廷頓基因突變會導(dǎo)致變異HTT蛋白的表達，這種蛋白容易聚集并干擾神經(jīng)元的功能。在真實的細胞環(huán)境中檢測聚集小體有助于更好地了解與聚集小體相關(guān)的疾病。聚集小體形成的檢測為鑒定抑制聚集小體形成的化合物提供了寶貴的讀數(shù)，可能在治療神經(jīng)退行性疾病方面發(fā)揮重要作用。

3．如何檢測凝集體？

有幾種方法可以檢測細胞中的凝集體。比如可以使用透射電子顯微鏡以及聚丙烯酰胺凝膠電泳，并結(jié)合 WB實驗。但是，這兩種方法都不適合高通量研究，因為它們非常耗時，而且生成的數(shù)據(jù)難以解讀。熒光顯微鏡可用于標記蛋白質(zhì)，在將其轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細胞后可對其聚集情況進行研究。但是，這種方法取決于可檢測到的標記蛋白質(zhì)的數(shù)量，這可能會限制研究，甚至還可能影響蛋白質(zhì)的聚集動力學。例如，GFP 蛋白（238 個氨基酸）比 β 淀粉樣肽（39-43 個氨基酸）大得多，可能會阻礙凝集小體的形成。

4. PROTEOSTAT® 檢測技術(shù)有哪些優(yōu)勢？

PROTEOSTAT® Aggresome detection kit（ENZ-51035-0025）提供了一種快速、特異和定量的方法，可在真實的細胞環(huán)境中鑒定與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的抑制劑。這種固定細胞檢測不需要非生理性蛋白質(zhì)突變或基因工程細胞系。PROTEOSTAT® Aggresome 檢測試劑盒含有一種新型 488 nm可激發(fā)紅色熒光分子轉(zhuǎn)子染料，可特異性檢測固定和通透細胞中聚集小體和類聚集小體包涵體中的變性蛋白質(zhì)貨物。PROTEOSTAT® 染料已在多種條件下與小分子調(diào)節(jié)劑一起進行了驗證，證明適用于篩選具有潛在治療價值的化合物，并為抗體共定位研究進行了優(yōu)化，以確定聚集蛋白貨物與自噬和聚集小體形成過程中涉及的各種蛋白之間的相互作用。

ROTEOSTAT® 檢測技術(shù)的主要特點包括：

1.可靠而簡單的檢測方法，無需非生理性蛋白質(zhì)突變或基因工程細胞系；

2.固定細胞檢測法經(jīng)過優(yōu)化，可用于抗體共定位研究，以確定聚集蛋白貨物和與聚集小體形成有關(guān)的各種蛋白之間的相互作用；

3.已在多種條件下進行了驗證，證明適用于篩選具有潛在治療價值的化合物；

4.可通過流式細胞儀和顯微鏡輕松量化聚集小體的積累；

圖 1. PROTEOSTAT® Aggresome 染料的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，ex/em 500/600 nm（圖 A）和 Hoechst 33342 的 ex/em 350/461 nm（圖 B）。所有光譜均在 1X 分析緩沖液中測定。

圖 2. PROTEOSTAT® Aggresome 染料可通過熒光顯微鏡檢測聚集小體內(nèi)的蛋白質(zhì)積累。用 0.2% DMSO（圖 A）或 5 μM MG-132（圖 B）在 37°C 下模擬誘導(dǎo) HeLa 細胞 12 小時。處理后，用 PROTEOSTAT® Aggresome 染料孵育細胞 30 分鐘。

圖 3. 熒光顯微鏡觀察到 PROTEOSTAT® 染料檢測到的細胞聚集小體與熒光素標記的識別 LC3I/II 的抗體共定位。在載玻片上用 5 μM MG-132 處理 HeLa 細胞 12 小時，并用 (A) PROTEOSTAT® 染料和 (B) 識別 LC3I/II 的熒光素標記抗體染色；(C) 顯示的是復(fù)合圖像。

圖 4. 基于流式細胞儀的分析。用 0.2% DMSO 或 5 μM MG-132 在 37°C 下模擬誘導(dǎo) Jurkat 細胞過夜。處理后，固定細胞并用 PROTEOSTAT® 染料孵育，然后在 FL3 通道使用 488 nm 激光進行流式細胞術(shù)分析，無需清洗。在經(jīng) MG-132 處理的細胞中，熒光紅色信號增加了約 3 倍。所述檢測方法可評估蛋白質(zhì)聚集的影響。