重組蛋白/細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)操作和選擇方法
在我們進(jìn)行抗體制備、ELISA、藥物研究、免疫實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)、晶體結(jié)構(gòu)分析等實(shí)驗(yàn)時(shí)，免不了要和重組蛋白打交道。MCE 重組蛋白產(chǎn)品涵蓋超過 2000 種不同功能的重組蛋白，具有批次間一致性，優(yōu)異的活性以及極低的內(nèi)毒素水平等特性，可用于多種不同領(lǐng)域的生物學(xué)研究。
小白：師兄師兄，我要買 human GM-CSF 用于體外細(xì)胞培養(yǎng)，網(wǎng)上一查，發(fā)現(xiàn)有好多種相似產(chǎn)品，看得我頭都大了。
師兄：這里面涉及的門道可多了，不僅要考慮到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模�要考慮產(chǎn)品的相關(guān)特性。
萌 Cece：重組蛋白/細(xì)胞因子選擇，有幾個(gè)重點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)，我給你們列出來了：
選擇因素 1：研究目的
在選擇產(chǎn)品前，要先清楚自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模鶕?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，我們就能排除一些干擾因素。
選擇因素 2：產(chǎn)品特性
1、活性數(shù)據(jù) (Biological Activity)
1）ED50半數(shù)有效量 (Median effective dose, ED50) 在量反應(yīng)中指能引起 50% 最大反應(yīng)強(qiáng)度的藥量，在質(zhì)反應(yīng)中指引起 50% 實(shí)驗(yàn)對象出現(xiàn)陽性反應(yīng)時(shí)的藥量。ED50 值越小，作用越強(qiáng)。
2）比活力 (Specific Activity)在特定條件下，單位重量 (mg) 蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)。對于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。
MCE 官網(wǎng)會顯示產(chǎn)品相關(guān)活性數(shù)據(jù)，各批次數(shù)據(jù)可能稍有差別。
2、內(nèi)毒素水平 (Endotoxin Level)
革蘭氏陰性菌的菌體中存在的毒性物質(zhì)的總稱，它是一種典型的熱原，哪怕是皮克級 (10-12g) 或納克級 (10-9g) 內(nèi)毒素進(jìn)入血液，也會引發(fā)各種生物反應(yīng)。
在選擇重組蛋白產(chǎn)品時(shí)，內(nèi)毒素水平也是參考的一大要素。特別是重組蛋白應(yīng)用于細(xì)胞/動物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)、藥物研究時(shí)，內(nèi)毒素水平會間接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
綜合以上兩個(gè)因素，我們就能從眾多產(chǎn)品中選出 C 位啦！畢竟，我們靠的是實(shí)力。
小白：師兄，我買的細(xì)胞因子，就這么一點(diǎn)點(diǎn)粉末，該怎么處理啊，可不能浪費(fèi)一丟丟。
師兄：市面上大部分重組蛋白是凍干粉形式，這也是方便蛋白保存和運(yùn)輸。買來的重組蛋白凍干粉可要謹(jǐn)慎溶解。
萌 Cece：說到這里，那本萌 Cece 就講講怎么更好地溶解重組蛋白吧~
第一步：開蓋前需離心
實(shí)驗(yàn)操作：10,000-12,000 rpm 離心 30 s。凍干粉在運(yùn)輸過程中會粘附于管壁或管蓋，在開蓋使用之前，需先離心，將凍干粉收集于管底。MCE 保證每管產(chǎn)品的蛋白總量達(dá)到標(biāo)示含量。
第二步：產(chǎn)品復(fù)溶
實(shí)驗(yàn)操作：向凍干粉中加入復(fù)溶 buffer/無菌水，用槍頭輕輕吹打混勻，重懸至濃度不低于 100 μg/mL。PS：將凍干粉稀釋到指定的濃度范圍，有利于維持重組蛋白良好的穩(wěn)定性。
第三步：產(chǎn)品保存
實(shí)驗(yàn)操作：
1) 實(shí)驗(yàn)周期＜1 周：復(fù)溶后的重組蛋白液體可放在 2-8℃ 保存；
2) 實(shí)驗(yàn)周期＞1 周/復(fù)溶的產(chǎn)品一次性用不完：將已重懸的蛋白溶液用含載體蛋白 (0.1% BSA，5% HAS，10% FBS，5% 海藻糖) 的溶液稀釋，分裝凍存。復(fù)溶后，-20℃ 可保存至少三個(gè)月，推薦 -80℃ 長期保存，以獲得更穩(wěn)定性能的產(chǎn)品。
載體蛋白可以預(yù)先封閉管壁上蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使重組蛋白末不會粘附于管壁。在分裝凍存前，用含載體蛋白的溶液稀釋可以保證低濃度的重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
小白：原來小小的一個(gè)產(chǎn)品里隱藏了這么多學(xué)問，漲知識啦！那有沒有其他需要注意的，我一并記下來。
師兄：之前只是知其然，現(xiàn)在是知其所以然。
萌 Cece：還有一些實(shí)驗(yàn)小細(xì)節(jié)哦，細(xì)胞因子特別注意不能影響其活性，以下幾點(diǎn)也要注意。
1、溶解過程中切記不要采用渦旋震蕩輔助溶解
我們習(xí)慣在固體溶解時(shí)采用渦旋震蕩助溶。但對于細(xì)胞因子來說，具備一定的空間結(jié)構(gòu)會使其活性更佳。正確實(shí)驗(yàn)操作是用移液器槍頭輕輕吹打混勻或者上下顛倒混勻。若無法做到充分溶解，可以將復(fù)溶產(chǎn)品至于水平搖床低速搖一段時(shí)間或 4℃ 靜置 2 h 以上。
2、稀釋用的含載體蛋白的溶液不能用水來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
特別注意的是，稀釋用的含載體蛋白的溶液指的是指有一定緩沖能力、pH 值為中性的溶液，如 PBS、培養(yǎng)液 DMEM 或者 RPMI1640 等。不能用水來代替。
3、重組蛋白活力值與計(jì)算方法
MCE 的重組蛋白產(chǎn)品并未采用 WHO 設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)來測定活力值，以上計(jì)算公式并不適用于 “International Units” 和 “ED50” 的轉(zhuǎn)換關(guān)系，需要采用國際標(biāo)準(zhǔn)品對比相同實(shí)驗(yàn)獲得該重組蛋白的 IU 值。
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產(chǎn)品選擇篇
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選擇因素 1：研究目的
在選擇產(chǎn)品前，要先清楚自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模鶕?jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，我們就能排除一些干擾因素。
選擇因素 2：產(chǎn)品特性
1、活性數(shù)據(jù) (Biological Activity)
1）ED50半數(shù)有效量 (Median effective dose, ED50) 在量反應(yīng)中指能引起 50% 最大反應(yīng)強(qiáng)度的藥量，在質(zhì)反應(yīng)中指引起 50% 實(shí)驗(yàn)對象出現(xiàn)陽性反應(yīng)時(shí)的藥量。ED50 值越小，作用越強(qiáng)。
2）比活力 (Specific Activity)在特定條件下，單位重量 (mg) 蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)。對于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。
MCE 官網(wǎng)會顯示產(chǎn)品相關(guān)活性數(shù)據(jù)，各批次數(shù)據(jù)可能稍有差別。
2、內(nèi)毒素水平 (Endotoxin Level)
革蘭氏陰性菌的菌體中存在的毒性物質(zhì)的總稱，它是一種典型的熱原，哪怕是皮克級 (10-12g) 或納克級 (10-9g) 內(nèi)毒素進(jìn)入血液，也會引發(fā)各種生物反應(yīng)。
在選擇重組蛋白產(chǎn)品時(shí)，內(nèi)毒素水平也是參考的一大要素。特別是重組蛋白應(yīng)用于細(xì)胞/動物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)、藥物研究時(shí)，內(nèi)毒素水平會間接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
綜合以上兩個(gè)因素，我們就能從眾多產(chǎn)品中選出 C 位啦！畢竟，我們靠的是實(shí)力。
產(chǎn)品溶解篇
小白：師兄，我買的細(xì)胞因子，就這么一點(diǎn)點(diǎn)粉末，該怎么處理啊，可不能浪費(fèi)一丟丟。
師兄：市面上大部分重組蛋白是凍干粉形式，這也是方便蛋白保存和運(yùn)輸。買來的重組蛋白凍干粉可要謹(jǐn)慎溶解。
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第一步：開蓋前需離心
實(shí)驗(yàn)操作：10,000-12,000 rpm 離心 30 s。凍干粉在運(yùn)輸過程中會粘附于管壁或管蓋，在開蓋使用之前，需先離心，將凍干粉收集于管底。MCE 保證每管產(chǎn)品的蛋白總量達(dá)到標(biāo)示含量。
第二步：產(chǎn)品復(fù)溶
實(shí)驗(yàn)操作：向凍干粉中加入復(fù)溶 buffer/無菌水，用槍頭輕輕吹打混勻，重懸至濃度不低于 100 μg/mL。PS：將凍干粉稀釋到指定的濃度范圍，有利于維持重組蛋白良好的穩(wěn)定性。
第三步：產(chǎn)品保存
實(shí)驗(yàn)操作：
1) 實(shí)驗(yàn)周期＜1 周：復(fù)溶后的重組蛋白液體可放在 2-8℃ 保存；
2) 實(shí)驗(yàn)周期＞1 周/復(fù)溶的產(chǎn)品一次性用不完：將已重懸的蛋白溶液用含載體蛋白 (0.1% BSA，5% HAS，10% FBS，5% 海藻糖) 的溶液稀釋，分裝凍存。復(fù)溶后，-20℃ 可保存至少三個(gè)月，推薦 -80℃ 長期保存，以獲得更穩(wěn)定性能的產(chǎn)品。
載體蛋白可以預(yù)先封閉管壁上蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使重組蛋白末不會粘附于管壁。在分裝凍存前，用含載體蛋白的溶液稀釋可以保證低濃度的重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
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1、溶解過程中切記不要采用渦旋震蕩輔助溶解
我們習(xí)慣在固體溶解時(shí)采用渦旋震蕩助溶。但對于細(xì)胞因子來說，具備一定的空間結(jié)構(gòu)會使其活性更佳。正確實(shí)驗(yàn)操作是用移液器槍頭輕輕吹打混勻或者上下顛倒混勻。若無法做到充分溶解，可以將復(fù)溶產(chǎn)品至于水平搖床低速搖一段時(shí)間或 4℃ 靜置 2 h 以上。
2、稀釋用的含載體蛋白的溶液不能用水來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
特別注意的是，稀釋用的含載體蛋白的溶液指的是指有一定緩沖能力、pH 值為中性的溶液，如 PBS、培養(yǎng)液 DMEM 或者 RPMI1640 等。不能用水來代替。
3、重組蛋白活力值與計(jì)算方法
MCE 的重組蛋白產(chǎn)品并未采用 WHO 設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)來測定活力值，以上計(jì)算公式并不適用于 “International Units” 和 “ED50” 的轉(zhuǎn)換關(guān)系，需要采用國際標(biāo)準(zhǔn)品對比相同實(shí)驗(yàn)獲得該重組蛋白的 IU 值。
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