文獻(xiàn)解讀：利用WGBS驗(yàn)證開(kāi)發(fā)新型DNA甲基化編輯多功能分子工具箱

大家好，這里是專(zhuān)注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。
 
近日，中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心何力副研究員和姚瑤博士為共同第一作者，南方科技大學(xué)朱健康院士（現(xiàn)澳門(mén)科技大學(xué)校長(zhǎng)）和郎曌博教授為共同通訊作者，在《Nature Communications》期刊發(fā)表題為“Versatile molecular tools enabling customizable DNA methylation editing in Arabidopsis”的科研成果，開(kāi)發(fā)了一套基于CRISPR/dCas9系統(tǒng)的定制化植物DNA甲基化精準(zhǔn)編輯工具箱。

該研究通過(guò)將催化失活的Cas9（dCas9）與多種DNA甲基化/去甲基化效應(yīng)蛋白（effectors）及表觀遺傳輔助因子（cofactors）融合，系統(tǒng)構(gòu)建了5種靶向甲基化工具和6種靶向去甲基化工具。此外，研究團(tuán)隊(duì)以擬南芥為模式生物，利用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）、染色質(zhì)可及性測(cè)序（ATAC-seq）等技術(shù)，系統(tǒng)評(píng)估了這些工具在FWA基因啟動(dòng)子、FT基因遠(yuǎn)端增強(qiáng)子及SDC基因啟動(dòng)子等位點(diǎn)的編輯效率、特異性及遺傳穩(wěn)定性等方面�？傊�，該工具箱實(shí)現(xiàn)了從位點(diǎn)特異性編輯到全基因組水平調(diào)控的多樣化應(yīng)用，且編輯后的甲基化修飾可在無(wú)轉(zhuǎn)基因狀態(tài)下穩(wěn)定遺傳，為植物表觀遺傳育種和功能研究提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。
 
英文標(biāo)題：Versatile molecular tools enabling customizable DNA methylation editing in Arabidopsis
中文標(biāo)題：多功能分子工具實(shí)現(xiàn)擬南芥DNA甲基化的精準(zhǔn)定制編輯
發(fā)表時(shí)間：2025年12月6日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、ATAC-seq
作者單位：中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心、南方科技大學(xué)
DOI:10.1038/s41467-025-66933-z

易小結(jié)
本研究在植物表觀遺傳工程領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了重大突破，系統(tǒng)性構(gòu)建并驗(yàn)證一套多功能、可遺傳的DNA甲基化編輯工具，將表觀基因組編輯從“概念驗(yàn)證”推向“工具箱化”應(yīng)用階段。
本研究充分展示了WGBS作為DNA甲基化檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)在表觀編輯效果評(píng)估中的核心地位。WGBS不僅能夠以單堿基分辨率精確量化目標(biāo)區(qū)域的甲基化水平，更能全面捕捉全基因組范圍內(nèi)的甲基化變化趨勢(shì)，為編輯工具的特異性評(píng)價(jià)提供了不可替代的數(shù)據(jù)支撐。

研究方法
（1）融合蛋白構(gòu)建

• 采用模塊化策略，將不同來(lái)源的效應(yīng)蛋白（甲基化酶DNMT3A-3L、DRM2、NtDRMcd、MQ1v；去甲基化酶ROS1、ROS1cd、TET1cd）與輔助因子（增強(qiáng)甲基化的KRAB、SRDX、KYP；增強(qiáng)去甲基化的p300、IBM1、IBM1cd）通過(guò)柔性連接肽（XTEN）分別融合到dCas9的N端和C端。使用pUBQ1或pRPS5A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，構(gòu)建于pCAMBIA1300載體中。

（2）植物材料與轉(zhuǎn)化

• 所有實(shí)驗(yàn)使用哥倫比亞生態(tài)型（Col-0）擬南芥。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化pCAMBIA1300二元載體，通過(guò)50mg/L潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株，將構(gòu)建好的工具載體分別轉(zhuǎn)入不同的遺傳背景（如fwa表觀等位基因系、野生型、nrpe1突變體等）中。

（3）表型分析

• 以開(kāi)花時(shí)間（通過(guò)蓮座葉數(shù)量量化）和葉片卷曲作為DNA甲基化狀態(tài)改變的直觀報(bào)告表型，分別對(duì)應(yīng)FWA、FT和SDC位點(diǎn)的編輯效果。

（4）分子水平檢測(cè)

• RT-qPCR：檢測(cè)靶基因（FWA, SDC）的表達(dá)水平變化。
• Western Blot：檢測(cè)dCas9融合蛋白的表達(dá)水平，分析工具效率與蛋白豐度的關(guān)系。

（5）核心表觀基因組學(xué)分析

• 全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）

1. 靶位點(diǎn)驗(yàn)證：精確評(píng)估FWA啟動(dòng)子、FT增強(qiáng)子Block C、SDC啟動(dòng)子等靶區(qū)域甲基化水平變化。
2. 特異性評(píng)估：分析靶位點(diǎn)周?chē)鷧^(qū)域及全基因組范圍的甲基化水平，量化工具的脫靶效應(yīng)。
3. 遺傳性分析：在T1、T2代（無(wú)論是否含有轉(zhuǎn)基因）中追蹤甲基化變化的遺傳穩(wěn)定性。
4. 差異甲基化區(qū)域（DMR）鑒定：系統(tǒng)鑒定全基因組范圍內(nèi)顯著高甲基化或低甲基化區(qū)域，并分析其基因組分布特征（如著絲粒周邊區(qū)域富集情況）以及與已知甲基化通路的關(guān)聯(lián)。

• ATAC-seq：

1. 5周齡野生型蓮座葉提取細(xì)胞核進(jìn)行ATAC-seq測(cè)序分析，以確定FT基因遠(yuǎn)端增強(qiáng)子Block C的開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域位置，為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

（6）遺傳穩(wěn)定性分析

• 通過(guò)T1代自交獲得T2代亞群，使用兩對(duì)引物（分別靶向gRNA和載體骨架）進(jìn)行基因型鑒定，區(qū)分含轉(zhuǎn)基因（+）和無(wú)轉(zhuǎn)基因（-）植株，評(píng)估甲基化編輯的跨代遺傳功能。

結(jié)果圖形
（1）基于Cas9的單融合蛋白用于DNA甲基化編輯
本研究設(shè)計(jì)了CRISPR-based融合蛋白系統(tǒng)，將效應(yīng)蛋白（甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基化酶）置于dCas9的N端，以?xún)?yōu)化其接觸胞嘧啶進(jìn)行編輯；將輔助因子（參與表觀調(diào)控的蛋白）置于dCas9的C端，以增強(qiáng)效應(yīng)蛋白的活性（圖1a）。具體而言，甲基化效應(yīng)蛋白包括哺乳動(dòng)物的DNMT3A-3L、擬南芥的DRM2、煙草的NtDRMcd和細(xì)菌變體MQ1v；去甲基化效應(yīng)蛋白包括擬南芥的ROS1及其催化域（ROS1cd）和人類(lèi)的TET1催化域（TET1cd）。輔助因子則包括轉(zhuǎn)錄抑制子（人源KRAB、擬南芥SRDX）、組蛋白H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶KYP、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300及H3K9me2去甲基化酶IBM1/IBM1cd。通過(guò)效應(yīng)蛋白、輔助因子和啟動(dòng)子的組合，構(gòu)建了38種甲基化編輯工具（M1-M38）和30種去甲基化編輯工具（D1-D30）。
 
（2）在FWA啟動(dòng)子區(qū)域的靶向DNA甲基化
研究以FWA啟動(dòng)子為首個(gè)測(cè)試靶點(diǎn)，該位點(diǎn)在野生型中通過(guò)DNA甲基化維持沉默，去甲基化導(dǎo)致晚花表型。研究團(tuán)隊(duì)測(cè)試了38種甲基化工具。通過(guò)觀察T1代植株是否恢復(fù)早花表型（圖1c、e）來(lái)初篩編輯工具。結(jié)果顯示，由pRPS5A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的工具（M6、M12、M14、M16、M22、M30）可誘導(dǎo)早花表型，而UBQ1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)工具無(wú)效，表明RPS5A啟動(dòng)子具有更優(yōu)的編輯效能。其中，MQ1v-dCas9 (M14) 和 MQ1v-dCas9-KRAB (M22) 誘導(dǎo)早花效率最高。RT-qPCR證實(shí)早花植株中FWA表達(dá)被抑制（圖1d）。

關(guān)鍵的WGBS分析（圖1f）直接證實(shí)，早花植株的FWA啟動(dòng)子區(qū)域被de novo甲基化，且不同工具誘導(dǎo)的甲基化類(lèi)型（CG或非CG）不同。如M14特異性誘導(dǎo)CG甲基化，而M22和M30可誘導(dǎo)CG和非CG甲基化，且M30的非CG甲基化水平高于M22，表明SRDX輔助因子可拓展MQ1v的非CG甲基化功能。

（3）FWA啟動(dòng)子甲基化工具的特異性表征
通過(guò)WGBS全基因組甲基化分析評(píng)估工具特異性，M6和M12編輯植株在FWA啟動(dòng)子及周?chē)鷧^(qū)域及全基因組范圍的甲基化水平與fwa對(duì)照無(wú)顯著差異（圖1f），表明其具有高度特異性。而M14在CG位點(diǎn)出現(xiàn)顯著甲基化，M22程度較輕，M30最低（圖1f）。全基因組CG甲基化水平分析（圖1g）顯示M14和M22顯著高于fwa，而M30與fwa類(lèi)似。值得注意的是，M14、M22、M30含同一效應(yīng)蛋白MQ1v，僅輔助因子不同，表明SRDX可顯著提高特異性。此外，工具的特異性與其在靶點(diǎn)的編輯效率大致呈負(fù)相關(guān)。

（4）靶向FWA啟動(dòng)子DNA甲基化的可遺傳性
為評(píng)估編輯的穩(wěn)定性，研究人員分析了編輯工具的T1代植株后代（T2代）。分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因分離后（T2代不含轉(zhuǎn)基因的植株），早花表型、FWA表達(dá)抑制以及FWA啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)依然穩(wěn)定存在（圖2a-c），表明這些工具誘導(dǎo)的甲基化修飾是可遺傳的表觀記憶，不依賴(lài)于轉(zhuǎn)基因的持續(xù)存在。
 
（5）FT基因遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的靶向DNA甲基化
為驗(yàn)證工具普適性，研究靶向FT基因增強(qiáng)子Block C，該位點(diǎn)甲基化導(dǎo)致野生型晚花（圖3a）。所有FWA有效工具（M6, M12, M14, M22, M30）均能在FT增強(qiáng)子誘導(dǎo)晚花表型（圖3b-c），但各工具效率排名有所變化，M6在FT位點(diǎn)效率最高，提示靶位點(diǎn)染色質(zhì)環(huán)境影響工具效能。WGBS分析再次確認(rèn)了工具的特異性差異（圖3d）：M12特異性甲基化靶位點(diǎn)且不改變?nèi)�基因組甲基化；M14在靶位點(diǎn)及周?chē)鶦G位點(diǎn)廣泛甲基化，M22和M30程度較輕；僅M14顯著提高全基因組CG甲基化，但效應(yīng)弱于FWA背景。有趣的是，M6在此并未檢測(cè)到明顯的DNA甲基化，推測(cè)其表型可能是通過(guò)輔助因子KYP誘導(dǎo)的H3K9me2間接導(dǎo)致。此外，編輯的遺傳性也在T2代中得到驗(yàn)證（圖3d-e）。
   
（6）FWA啟動(dòng)子區(qū)域的靶向DNA去甲基化
研究同時(shí)構(gòu)建了30種去甲基化工具。在野生型（其FWA啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致基因沉默）中靶向該區(qū)域，成功去甲基化將激活FWA表達(dá)并導(dǎo)致晚花表型（圖4a）。篩選發(fā)現(xiàn)，由pRPS5A驅(qū)動(dòng)的工具效果更好，其中ROS1-dCas9 (D10)、TET1cd-dCas9 (D12)、TET1cd-dCas9-p300 (D18)、TET1cd-dCas9-IBM1cd (D24) 和 TET1cd-dCas9-IBM1 (D30) 能誘導(dǎo)不同程度的晚花（圖4b、d）。RT-qPCR顯示FWA激活與甲基化降低負(fù)相關(guān)（圖4c），WGBS分析直接證實(shí)這些植株的FWA啟動(dòng)子發(fā)生了去甲基化，且TET1cd-based工具（D12、D24, D30）的去甲基化效能優(yōu)于ROS1工具（D10）（圖4e）。
 
（7）FWA啟動(dòng)子去甲基化工具的特異性表征
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)WGBS全基因組甲基化分析揭示了去甲基化工具的特異性譜系（圖4f）。ROS1-dCas9(D10)和TET1cd-dCas9-p300(D18)特異性最高，全基因組甲基化水平與野生型相似。TET1cd-dCas9 (D12)和TET1cd-dCas9-IBM1cd(D24)有輕微的全局去甲基化效應(yīng)。而TET1cd-dCas9-IBM1(D30)顯著降低全基因組CG甲基化，特異性最低但效率最高。表明輔助因子p300有助于提高特異性，而IBM1則增強(qiáng)效率的輔助因子效應(yīng)。

（8）FWA啟動(dòng)子的靶向DNA去甲基化可遺傳性
與甲基化工具類(lèi)似，去甲基化工具誘導(dǎo)的修飾也能穩(wěn)定遺傳。在T2代植株（無(wú)論是否含轉(zhuǎn)基因）中，仍能觀察到晚花表型（圖5a）、FWA表達(dá)激活（圖5b）以及FWA啟動(dòng)子的低甲基化狀態(tài)（圖5c）。例如，D10工具在T1代僅部分去甲基化，但在部分T2代中實(shí)現(xiàn)了完全去甲基化，表明ROS1可能需要多代傳遞才能達(dá)到完全效果。WGBS跨代數(shù)據(jù)確立了去甲基化修飾的穩(wěn)定遺傳功能。
 
（9）SDC啟動(dòng)子區(qū)域的靶向去甲基化
研究團(tuán)隊(duì)分析了另一個(gè)受RdDM通路調(diào)控甲基化的靶標(biāo)SDC啟動(dòng)子，該位點(diǎn)甲基化沉默SDC，去甲基化激活導(dǎo)致葉片卷曲（圖6a）。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型中所有去甲基化工具在T1代均未能誘導(dǎo)出預(yù)期的卷葉表型（圖6d），ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示SDC啟動(dòng)子富集于RdDM通路核心組分Pol IV，推測(cè)RdDM通路拮抗去甲基化。于是研究團(tuán)隊(duì)將工具轉(zhuǎn)入RdDM缺失介導(dǎo)的nrpe1突變體中，成功在T1代觀察到卷葉表型（圖6b、d），其中TET1cd-dCas9-IBM1 (D30) 和 TET1cd-dCas9 (D12) 效率最高。RT-qPCR和WGBS（圖6c、e）證實(shí)卷曲葉植株SDC表達(dá)激活且啟動(dòng)子去甲基化。此外在野生型背景下，部分高效工具在T2代也誘導(dǎo)出卷葉表型。WGBS證實(shí)其SDC啟動(dòng)子去甲基化和基因激活，表明IBM1輔助因子可提升ROS1工具效能。
  （10）SDC啟動(dòng)子去甲基化工具的特異性表征
SDC位點(diǎn)及全基因組甲基化（圖6e-f）WGBS分析進(jìn)一步驗(yàn)證了工具的特異性特征：TET1cd-dCas9-p300 (D18) 特異性高；TET1cd-dCas9 (D12) 和 TET1cd-dCas9-IBM1cd (D24) 特異性較低；TET1cd-dCas9-IBM1 (D30) 在部分植株中能導(dǎo)致強(qiáng)烈的全基因組去甲基化；而ROS1-dCas9-IBM1 (D28) 則表現(xiàn)出誘導(dǎo)全基因組CHG去甲基化的傾向。WGBS全面描繪了不同工具在RdDM缺失和野生型背景下的特異性差異。

（11）SDC啟動(dòng)子的靶向DNA甲基化可遺傳
最后，研究團(tuán)隊(duì)分析了nrpe1背景T1編輯植株的后代。分析結(jié)果顯示，在nrpe1背景下，去甲基化工具誘導(dǎo)的卷葉表型、SDC表達(dá)激活以及啟動(dòng)子低甲基化狀態(tài)，在T2代（無(wú)論是否含轉(zhuǎn)基因）中均能穩(wěn)定遺傳（圖7a-c）。即使在野生型背景下，T30誘導(dǎo)的全基因組CG低甲基化和D28誘導(dǎo)的全基因組CHG低甲基化，在無(wú)轉(zhuǎn)基因的T2代中也得以保留，再次證明這些表觀編輯的遺傳穩(wěn)定性。
   
結(jié)論和啟示
本研究成功開(kāi)發(fā)了一套多功能、可定制化的植物DNA甲基化編輯工具箱，包含5種甲基化工具（M6、M12、M14、M22、M30）和6種去甲基化工具（D10、D12、D18、D24、D28、D30），實(shí)現(xiàn)了從位點(diǎn)特異性到全基因組水平、從瞬時(shí)表達(dá)到跨代遺傳的多樣化應(yīng)用。

核心亮點(diǎn)包括：

• 輔助因子工程是優(yōu)化編輯工具的關(guān)鍵策略；
• WGBS等全基因組測(cè)序技術(shù)是評(píng)估表觀編輯特異性和遺傳穩(wěn)定性的重要工具；
• 植物表觀基因組編輯技術(shù)已基本具備從基礎(chǔ)研究走向育種應(yīng)用；
• 不同靶位點(diǎn)的染色質(zhì)環(huán)境（如RdDM通路活性）顯著影響工具選擇策略。

未來(lái)研究可拓展至更多植物物種，結(jié)合單細(xì)胞WGBS和時(shí)空特異性表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的表觀遺傳調(diào)控。

參考文獻(xiàn)：He L, Yao Y, You Y, Wei X, Ma Y, Yuan W, Lang Z, Zhu JK. Versatile molecular tools enabling customizable DNA methylation editing in Arabidopsis. Nat Commun. 2025 Dec 6. doi: 10.1038/s41467-025-66933-z.