METTL1介導(dǎo)RNA m7G甲基化在急性腎臟炎癥中的致病機(jī)制及治療潛力
大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。
近日，安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)科學(xué)學(xué)院謝帥帥等為第一作者、孟曉明教授等為通訊作者，在國際腎臟病領(lǐng)域頂級期刊《Kidney International》發(fā)表題為“The m7G methyltransferase METTL1 promotes acute kidney inflammation by disrupting mitochondrial function”科研成果。研究通過表觀轉(zhuǎn)錄組測序（MeRIP-seq）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）等揭示了RNA修飾N7-甲基鳥苷（m7G）及其甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白1（METTL1）在急性腎損傷（AKI）中的核心致病機(jī)制。
研究首先發(fā)現(xiàn)AKI患者及小鼠模型的腎小管上皮細(xì)胞（TECs）中METTL1表達(dá)和m7G修飾水平顯著上調(diào)，且受轉(zhuǎn)錄因子CREB1調(diào)控。接著，通過構(gòu)建腎小管節(jié)段特異性METTL1條件性敲除小鼠并利用多組學(xué)測序和功能驗(yàn)證，證實(shí)METTL1缺失可顯著減輕順鉑、缺血/再灌注（I/R）及盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）三種AKI模型的腎臟損傷和炎癥反應(yīng)�？傊�研究整合RNA測序（RNA-seq）與m7G甲基化測序（m7G MeRIP-seq）技術(shù)，揭示METTL1通過m7G修飾穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子TEAD2的mRNA，進(jìn)而抑制線粒體脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶ACADM轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致線粒體功能障礙并加劇腎臟炎癥。
研究不僅闡明了“METTL1/TEAD2/ACADM”致病軸，還基于此開發(fā)了兩種靶向干預(yù)策略：tFNA-siMettl1納米遞送系統(tǒng)和METTL1小分子抑制劑AZD1080，驗(yàn)證了靶向METTL1的治療潛力，為AKI的臨床干預(yù)提供了新的分子靶點(diǎn)和轉(zhuǎn)化策略。
英文標(biāo)題：The m7G methyltransferase METTL1 promotes acute kidney inflammation by disrupting mitochondrial function
中文標(biāo)題：m7G甲基轉(zhuǎn)移酶METTL1通過破壞線粒體功能促進(jìn)急性腎臟炎癥
發(fā)表時(shí)間：2025年12月15日
發(fā)表期刊：Kidney International
影響因子：IF12.6/Q1
技術(shù)平臺(tái)：m7G MeRIP-seq、RNA-seq
作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)
DOI：10.1016/J.Kint.2025.11.010
易小結(jié)
本研究系統(tǒng)闡明METTL1介導(dǎo)的m7G修飾在急性腎臟炎癥中的病理生理作用，并轉(zhuǎn)化為可操作的臨床干預(yù)方案，實(shí)現(xiàn)從基礎(chǔ)機(jī)制到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)完整研究鏈。
該研究利用m7G MeRIP-seq實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m7G修飾位點(diǎn)精準(zhǔn)定位，為解析RNA修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。未來可應(yīng)用于各類炎癥性疾病、代謝性疾病及腫瘤的表觀轉(zhuǎn)錄組研究，助力發(fā)現(xiàn)疾病特異性RNA修飾標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展。
研究方法
（1） 樣本及模型
（1）METTL1在AKI患者和小鼠的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
本研究首先在臨床和動(dòng)物樣本中確定了METTL1與AKI的相關(guān)性。Dot blot結(jié)果顯示，在順鉑、缺血/再灌注（I/R）和盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）誘導(dǎo)的多種AKI小鼠模型中，腎臟組織的整體m7G修飾水平顯著升高（圖1a）。同時(shí)，METTL1及其輔因子WDR4蛋白和mRNA表達(dá)在AKI小鼠腎組織中同樣顯著上調(diào)（圖1b-c）。通過免疫熒光共定位分析，發(fā)現(xiàn)METTL1升高主要富集于受損的腎小管上皮細(xì)胞（圖1d）。這一現(xiàn)象在AKI患者的腎活檢組織中也得到證實(shí)（圖1e）。在體外實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)順鉑、缺氧/復(fù)氧（H/R）或脂多糖（LPS）刺激的人腎小管上皮細(xì)胞（HK2）或人原代TECs，同樣觀察到m7G水平及METTL1/WDR4表達(dá)增加（圖1f-i）。此外，通過多數(shù)據(jù)庫預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CREB1在損傷條件下結(jié)合至METTL1基因啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄上調(diào)（圖1j-m）。上述研究結(jié)果奠定了METTL1作為AKI潛在關(guān)鍵調(diào)控分子的基礎(chǔ)。
（2）METTL1促進(jìn)小鼠腎臟及培養(yǎng)細(xì)胞的腎損傷和炎癥反應(yīng)
為明確METTL1功能，研究者構(gòu)建了基因敲除小鼠模型。全身性Mettl1純合敲除導(dǎo)致胚胎致死，而雜合敲除（Mettl1+/-）能部分緩解AKI。為在目標(biāo)細(xì)胞中更精確研究，研究者構(gòu)建了腎小管上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠：利用Ggt-Cre和Cdh16-Cre分別敲除近端小管和遠(yuǎn)端小管/集合管中的Mettl1（圖2a、k）。在順鉑誘導(dǎo)的AKI模型中，與對照組（Mettl1flox/flox）相比，兩種特異性敲除小鼠的腎臟m7G修飾水平、血清肌酐和尿素氮均顯著降低，腎小管損傷（PAS染色）和細(xì)胞凋亡（TUNEL染色）顯著減輕，巨噬細(xì)胞浸潤減少，炎癥標(biāo)志物p-P65和KIM-1表達(dá)下調(diào)（圖2d-h、m-o）。在I/R和CLP模型中，Mettl1敲除也表現(xiàn)出類似腎臟保護(hù)作用（圖2i-j）。
研究進(jìn)一步在HK2細(xì)胞中進(jìn)行功能獲得和功能缺失驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)。METTL1敲低可抑制順鉑誘導(dǎo)的m7G水平升高、NF-κB活化（p-P65）及炎癥因子（TNF-α, CCL2, IL-1β）表達(dá)，而過表達(dá)METTL1則加劇這些損傷表型（圖3b-i）。類似結(jié)果在H/R和LPS刺激模型以及小鼠原代TECs中得到重復(fù)驗(yàn)證（圖3k-n）。Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，METTL1促損傷作用與其和WDR4的互作增強(qiáng)相關(guān)（圖3j）。上述研究結(jié)果驗(yàn)證了METTL1在腎小管上皮細(xì)胞中是AKI的致病因子。
（3）METTL1通過介導(dǎo)內(nèi)部m7G修飾穩(wěn)定TEAD2 mRNA
為闡明METTL1促進(jìn)急性腎臟炎癥的分子機(jī)制，研究者對順鉑刺激的對照和METTL1敲低的HK2細(xì)胞進(jìn)行了m7G MeRIP-seq和RNA-seq（圖4a）。m7G MeRIP-seq分析鑒定出1115個(gè)低甲基化和945個(gè)高甲基化peaks，這些peaks主要富集在mRNA的編碼區(qū)（CDS）鄰近起始密碼子和終止密碼子附近，并存在GA-rich motif（圖4b-d）。通路富集分析顯示，METTL1調(diào)控的m7G修飾基因與炎癥通路密切相關(guān)（圖4e）。通過整合分析，篩選出64個(gè)在METTL1敲低后同時(shí)出現(xiàn)m7G修飾降低和mRNA表達(dá)下調(diào)基因（圖4f）。經(jīng)過進(jìn)一步功能篩選，鑒定出轉(zhuǎn)錄因子TEAD2為METTL1的關(guān)鍵下游靶標(biāo)。
m7G MeRIP-seq圖譜和MeRIP-qPCR驗(yàn)證均顯示，在順鉑或H/R刺激下，TEAD2 mRNA上的m7G修飾顯著增加，而METTL1敲低則特異性降低這些修飾（圖4g-i）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明，METTL1對TEAD2表達(dá)的調(diào)控依賴于其mRNA上的特定m7G修飾位點(diǎn)（圖4j）。進(jìn)一步機(jī)制研究表明，METTL1敲低縮短TEAD2 mRNA半衰期（圖4l）。先前研究表明內(nèi)部m7G結(jié)合蛋白Quaking（QKI）與TEAD2 mRNA結(jié)合，且QKI敲低會(huì)降低TEAD2的穩(wěn)定性和表達(dá)（圖4m-o）。因此，上述研究結(jié)果揭示METTL1通過催化TEAD2 mRNA的內(nèi)部m7G修飾，經(jīng)由QKI依賴性方式增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而上調(diào)TEAD2蛋白水平。
(b) m7G MeRIP-seq鑒定出的差異甲基化基因火山圖。
(c) m7G peaks在轉(zhuǎn)錄本上的分布Metagene圖。
(d) m7G peaks富集的序列motifs。
(e) METTL1介導(dǎo)的m7G修飾基因的KEGG通路富集分析。
(f) 低甲基化與下調(diào)基因之間的重疊分析熱圖。
(g) TEAD2 mRNA內(nèi)部m7G甲基化位點(diǎn)可視化圖。
(h-i) MeRIP-qPCR分析順鉑和缺氧/復(fù)氧處理的HK2細(xì)胞TEAD2 mRNA的m7G修飾水平。
(j) METTL1敲低的順鉑處理HK2細(xì)胞，對野生型和突變型TEAD2報(bào)告基因進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。
(k) Western blot分析METTL1敲低和TEAD2過表達(dá)的順鉑處理HK2細(xì)胞的TEAD2和p-P65蛋白水平。
(l) 在METTL1敲低的順鉑處理HK2細(xì)胞中，進(jìn)行TEAD2 mRNA的RNA衰減實(shí)驗(yàn)。
(m) 在順鉑處理的HK2細(xì)胞中，通過RIP實(shí)驗(yàn)評估QKI與TEAD2 mRNA的結(jié)合。
(n) 在QKI敲低的順鉑處理HK2細(xì)胞中，通過實(shí)時(shí)定量PCR分析TEAD2 mRNA水平。
(o) 在QKI敲低的順鉑處理HK2細(xì)胞中，進(jìn)行TEAD2 mRNA的RNA衰減實(shí)驗(yàn)。
（4）TEAD2沉默減輕METTL1介導(dǎo)的腎損傷和炎癥
為驗(yàn)證TEAD2作為METTL1下游效應(yīng)分子的功能，研究者進(jìn)行一系列功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。免疫熒光顯示，在AKI小鼠的受損腎小管中，TEAD2表達(dá)在TECs核內(nèi)顯著上調(diào)（圖5a）。在HK2細(xì)胞中敲低TEAD2能有效抑制順鉑或H/R誘導(dǎo)的NF-κB活化和炎癥因子表達(dá)（圖5b-c）。
在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過腎盂注射攜帶Ksp-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Tead2 shRNA的AAV9病毒，實(shí)現(xiàn)腎小管特異性Tead2敲低，可顯著改善順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠的腎功能、組織損傷和炎癥反應(yīng)（圖5d-h）。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠中QKI蛋白與Tead2 mRNA互作（圖5i）。最重要的功能挽救實(shí)驗(yàn)顯示，在Mettl1flox/floxGgt-Cre小鼠中恢復(fù)TEAD2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Mettl1缺失對順鉑誘導(dǎo)AKI的腎臟保護(hù)作用，重新加重腎損傷和炎癥（圖5j-l）。證實(shí)TEAD2是METTL1下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子。
（5）TEAD2介導(dǎo)的ACADM抑制損害線粒體功能
既往研究報(bào)道TEAD2在腫瘤中作為代謝酶的轉(zhuǎn)錄抑制因子，研究者深入探索TEAD2如何導(dǎo)致線粒體功能障礙。通過生物信息學(xué)預(yù)測和ChIP-qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TEAD2能直接結(jié)合到中鏈�；o酶A脫氫酶（ACADM）基因的啟動(dòng)子區(qū)域（圖6a）。ACADM是線粒體脂肪酸β-氧化（FAO）的關(guān)鍵限速酶。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定TEAD2結(jié)合的具體序列，并證實(shí)TEAD2過表達(dá)會(huì)抑制ACADM的啟動(dòng)子活性（圖6b）。在AKI模型中，ACADM表達(dá)被抑制，而Mettl1敲除可恢復(fù)其表達(dá)，這種恢復(fù)效應(yīng)可被TEAD2過表達(dá)所抵消（圖6c-d）。
具體而言，METTL1敲低能改善順鉑刺激的HK2細(xì)胞的線粒體耗氧率（OCR）、膜電位，并緩解線粒體碎片化，而TEAD2過表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了這些保護(hù)效應(yīng)（圖6e-h）。在動(dòng)物模型中，Mettl1敲除小鼠的腎臟表現(xiàn)出更高的ATP水平、mtDNA拷貝數(shù)、線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物TFAM，更完整的線粒體超微結(jié)構(gòu)，以及脂質(zhì)堆積減少（圖6i-l）。上述研究結(jié)果闡明了“METTL1上調(diào)→EAD2 mRNA穩(wěn)定→TEAD2蛋白增加→抑制ACADM轉(zhuǎn)錄→FAO受損→線粒體功能障礙→促進(jìn)炎癥”的致病軸。
（6）Mettl1敲低對腎臟炎癥的保護(hù)作用
基于上述機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了兩種干預(yù)策略。
tFNA-siMettl1納米遞送系統(tǒng)：研究團(tuán)隊(duì)利用具有良好生物相容性和組織穿透性的四面體框架核酸（tFNA）作為載體，裝載靶向Mettl1的siRNA，構(gòu)建了tFNA-siMettl1復(fù)合體。體內(nèi)成像顯示該復(fù)合體能高效靶向蓄積于腎臟。在順鉑或CLP誘導(dǎo)的AKI小鼠模型中，預(yù)防性給予tFNA-siMettl1，能有效降低腎臟m7G水平、METTL1和TEAD2表達(dá)，恢復(fù)ACADM水平，從而顯著改善腎功能、減輕組織病理損傷、抑制炎癥，并保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果證明基于核酸納米技術(shù)的基因治療策略在AKI中的可行性。
METTL1小分子抑制劑AZD1080：研究團(tuán)隊(duì)同步探索了小分子藥物干預(yù)策略。通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選和細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，鑒定出AZD1080作為一種新型METTL1抑制劑。分子對接和結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)其與METTL1直接互作。在細(xì)胞模型中，AZD1080能以劑量依賴方式抑制損傷誘導(dǎo)的m7G水平升高、NF-κB活化和炎癥。在動(dòng)物模型中，無論是預(yù)防性給藥（在AKI誘導(dǎo)前）還是治療性給藥（在AKI誘導(dǎo)后），AZD1080都能劑量依賴性降低m7G修飾，改善腎功能和腎臟病理，下調(diào)TEAD2并上調(diào)ACADM，且未觀察到明顯器官毒性。這為開發(fā)靶向METTL1的口服小分子藥物提供了先導(dǎo)化合物和概念驗(yàn)證。
結(jié)論和啟示
本研究通過MeRIP-seq、RNA-seq分子機(jī)制探索及體內(nèi)外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)綜合揭示了腎小管上皮細(xì)胞中METTL1是急性腎炎癥的關(guān)鍵致病因子。METTL1通過介導(dǎo)TEAD2 mRNA的內(nèi)部m7G修飾增強(qiáng)其穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制ACADM依賴性脂肪酸氧化，導(dǎo)致線粒體功能障礙并加劇炎癥反應(yīng)。此外，靶向METTL1/TEAD2/ACADM軸（tFNA-siRNA納米遞送/小分子抑制劑AZD1080），均能有效緩解腎臟驗(yàn)證。
m7G MeRIP-seq在本研究中的重要作用
m7G MeRIP-seq通過特異性抗m7G抗體免疫沉淀結(jié)合高通量測序，首次在AKI細(xì)胞模型中系統(tǒng)鑒定了1115個(gè)低甲基化和945個(gè)高甲基化peaks，明確了m7G修飾在編碼序列（CDS）區(qū)域的分布特征及GA-rich motif的富集規(guī)律，為后續(xù)靶基因篩選提供了大數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。并通過整合RNA-seq多組學(xué)數(shù)據(jù)篩選出TEAD2作為METTL1的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)，為機(jī)制驗(yàn)證提供特異性位點(diǎn)信息。
參考文獻(xiàn)：Xie SS, Dong YH, Gao J, Li W, Xu L, Wang JN, Yu JT, Hou C, Li C, Gao YY, Dong ZH, Ma WX, Hou R, Sun S, Ji ML, He RB, Suo XG, Ni WJ, Wen JG, Jin J, Yang Q, Cai H, Meng XM. The m7G methyltransferase METTL1 promotes acute kidney inflammation by disrupting mitochondrial function. Kidney Int. 2025 Dec 15. doi: 10.1016/j.kint.2025.11.010.
近日，安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)科學(xué)學(xué)院謝帥帥等為第一作者、孟曉明教授等為通訊作者，在國際腎臟病領(lǐng)域頂級期刊《Kidney International》發(fā)表題為“The m7G methyltransferase METTL1 promotes acute kidney inflammation by disrupting mitochondrial function”科研成果。研究通過表觀轉(zhuǎn)錄組測序（MeRIP-seq）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）等揭示了RNA修飾N7-甲基鳥苷（m7G）及其甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白1（METTL1）在急性腎損傷（AKI）中的核心致病機(jī)制。
研究首先發(fā)現(xiàn)AKI患者及小鼠模型的腎小管上皮細(xì)胞（TECs）中METTL1表達(dá)和m7G修飾水平顯著上調(diào)，且受轉(zhuǎn)錄因子CREB1調(diào)控。接著，通過構(gòu)建腎小管節(jié)段特異性METTL1條件性敲除小鼠并利用多組學(xué)測序和功能驗(yàn)證，證實(shí)METTL1缺失可顯著減輕順鉑、缺血/再灌注（I/R）及盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）三種AKI模型的腎臟損傷和炎癥反應(yīng)�？傊�研究整合RNA測序（RNA-seq）與m7G甲基化測序（m7G MeRIP-seq）技術(shù)，揭示METTL1通過m7G修飾穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子TEAD2的mRNA，進(jìn)而抑制線粒體脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶ACADM轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致線粒體功能障礙并加劇腎臟炎癥。
研究不僅闡明了“METTL1/TEAD2/ACADM”致病軸，還基于此開發(fā)了兩種靶向干預(yù)策略：tFNA-siMettl1納米遞送系統(tǒng)和METTL1小分子抑制劑AZD1080，驗(yàn)證了靶向METTL1的治療潛力，為AKI的臨床干預(yù)提供了新的分子靶點(diǎn)和轉(zhuǎn)化策略。
英文標(biāo)題：The m7G methyltransferase METTL1 promotes acute kidney inflammation by disrupting mitochondrial function
中文標(biāo)題：m7G甲基轉(zhuǎn)移酶METTL1通過破壞線粒體功能促進(jìn)急性腎臟炎癥
發(fā)表時(shí)間：2025年12月15日
發(fā)表期刊：Kidney International
影響因子：IF12.6/Q1
技術(shù)平臺(tái)：m7G MeRIP-seq、RNA-seq
作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)
DOI：10.1016/J.Kint.2025.11.010
易小結(jié)
本研究系統(tǒng)闡明METTL1介導(dǎo)的m7G修飾在急性腎臟炎癥中的病理生理作用，并轉(zhuǎn)化為可操作的臨床干預(yù)方案，實(shí)現(xiàn)從基礎(chǔ)機(jī)制到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)完整研究鏈。
該研究利用m7G MeRIP-seq實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m7G修飾位點(diǎn)精準(zhǔn)定位，為解析RNA修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。未來可應(yīng)用于各類炎癥性疾病、代謝性疾病及腫瘤的表觀轉(zhuǎn)錄組研究，助力發(fā)現(xiàn)疾病特異性RNA修飾標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展。
研究方法
（1） 樣本及模型
- 臨床樣本及動(dòng)物模型：收集AKI患者及對照腎組織樣本；構(gòu)建三種經(jīng)典的AKI小鼠模型（順鉑誘導(dǎo)、缺血/再灌注、盲腸結(jié)扎穿孔致膿毒癥）。
- 基因敲除小鼠模型：構(gòu)建全身性雜合敲除小鼠（Mettl1+/-）、近端腎小管特異性Mettl1條件性敲除小鼠（Mettl1flox/floxGgt-Cre）、遠(yuǎn)端腎小管及集合管特異性Mettl1條件性敲除小鼠（Mettl1flox/floxCdh16-Cre）。
- 損傷模擬：使用人腎小管上皮細(xì)胞系（HK2）及原代TECs，應(yīng)用順鉑、缺氧/復(fù)氧（H/R）模擬缺血、脂多糖（LPS）模擬炎癥等刺激模擬AKI損傷。
- 基因操作：METTL1、TEAD2、QKI、CREB1等基因的siRNA敲低及過表達(dá)
- 檢測指標(biāo)：m7G修飾水平（Dot blot）、炎癥因子mRNA水平（qPCR）、蛋白表達(dá)（Western blot）、NF-κB活化（p-P65）、細(xì)胞凋亡（TUNEL）等
- RNA-seq：分析METTL1敲低后順鉑刺激HK2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化，篩選差異表達(dá)基因
- m7G MeRIP-seq：對順鉑刺激下對照和METTL1敲低的HK2細(xì)胞進(jìn)行測序，全局性鑒定METTL1依賴的m7G修飾位點(diǎn)與靶基因。
- 綜合分析：結(jié)合RNA-seq與m7G MeRIP-seq數(shù)據(jù)，篩選出同時(shí)發(fā)生低甲基化和表達(dá)下調(diào)的基因，從而鎖定關(guān)鍵下游效應(yīng)分子TEAD2。
- RNA免疫沉淀（RIP）：驗(yàn)證QKI蛋白與TEAD2 mRNA的結(jié)合。
- 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）：驗(yàn)證CREB1與METTL1啟動(dòng)子的結(jié)合。
- mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：放線菌素D處理檢測mRNA半衰期。
- 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：構(gòu)建野生型及突變型TEAD2報(bào)告基因，驗(yàn)證m7G修飾位點(diǎn)功能；構(gòu)建ACADM啟動(dòng)子報(bào)告基因，驗(yàn)證TEAD2的轉(zhuǎn)錄抑制功能。
- tFNA-siMettl1納米遞送系統(tǒng)：設(shè)計(jì)并構(gòu)建了四面體框架核酸（tFNA）作為載體，遞送靶向Mettl1的siRNA（tFNA-siMettl1），用于體內(nèi)基因沉默治療。
- METTL1小分子抑制劑AZD1080：通過計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選化合物庫，結(jié)合細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，鑒定出新型METTL1抑制劑AZD1080，并在細(xì)胞和動(dòng)物模型中驗(yàn)證其療效。
（1）METTL1在AKI患者和小鼠的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
本研究首先在臨床和動(dòng)物樣本中確定了METTL1與AKI的相關(guān)性。Dot blot結(jié)果顯示，在順鉑、缺血/再灌注（I/R）和盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）誘導(dǎo)的多種AKI小鼠模型中，腎臟組織的整體m7G修飾水平顯著升高（圖1a）。同時(shí)，METTL1及其輔因子WDR4蛋白和mRNA表達(dá)在AKI小鼠腎組織中同樣顯著上調(diào)（圖1b-c）。通過免疫熒光共定位分析，發(fā)現(xiàn)METTL1升高主要富集于受損的腎小管上皮細(xì)胞（圖1d）。這一現(xiàn)象在AKI患者的腎活檢組織中也得到證實(shí)（圖1e）。在體外實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)順鉑、缺氧/復(fù)氧（H/R）或脂多糖（LPS）刺激的人腎小管上皮細(xì)胞（HK2）或人原代TECs，同樣觀察到m7G水平及METTL1/WDR4表達(dá)增加（圖1f-i）。此外，通過多數(shù)據(jù)庫預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CREB1在損傷條件下結(jié)合至METTL1基因啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄上調(diào)（圖1j-m）。上述研究結(jié)果奠定了METTL1作為AKI潛在關(guān)鍵調(diào)控分子的基礎(chǔ)。
圖1：在急性腎損傷期間，腎小管上皮細(xì)胞中的METTL1表達(dá)上調(diào)
（2）METTL1促進(jìn)小鼠腎臟及培養(yǎng)細(xì)胞的腎損傷和炎癥反應(yīng)
為明確METTL1功能，研究者構(gòu)建了基因敲除小鼠模型。全身性Mettl1純合敲除導(dǎo)致胚胎致死，而雜合敲除（Mettl1+/-）能部分緩解AKI。為在目標(biāo)細(xì)胞中更精確研究，研究者構(gòu)建了腎小管上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠：利用Ggt-Cre和Cdh16-Cre分別敲除近端小管和遠(yuǎn)端小管/集合管中的Mettl1（圖2a、k）。在順鉑誘導(dǎo)的AKI模型中，與對照組（Mettl1flox/flox）相比，兩種特異性敲除小鼠的腎臟m7G修飾水平、血清肌酐和尿素氮均顯著降低，腎小管損傷（PAS染色）和細(xì)胞凋亡（TUNEL染色）顯著減輕，巨噬細(xì)胞浸潤減少，炎癥標(biāo)志物p-P65和KIM-1表達(dá)下調(diào)（圖2d-h、m-o）。在I/R和CLP模型中，Mettl1敲除也表現(xiàn)出類似腎臟保護(hù)作用（圖2i-j）。
研究進(jìn)一步在HK2細(xì)胞中進(jìn)行功能獲得和功能缺失驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)。METTL1敲低可抑制順鉑誘導(dǎo)的m7G水平升高、NF-κB活化（p-P65）及炎癥因子（TNF-α, CCL2, IL-1β）表達(dá)，而過表達(dá)METTL1則加劇這些損傷表型（圖3b-i）。類似結(jié)果在H/R和LPS刺激模型以及小鼠原代TECs中得到重復(fù)驗(yàn)證（圖3k-n）。Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，METTL1促損傷作用與其和WDR4的互作增強(qiáng)相關(guān)（圖3j）。上述研究結(jié)果驗(yàn)證了METTL1在腎小管上皮細(xì)胞中是AKI的致病因子。
圖2：TECs特異性敲除Mettl1可改善順鉑和缺血/再灌注誘導(dǎo)的腎功能障礙、損傷和炎癥
圖3：METTL1在體外實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)細(xì)胞損傷和炎癥以響應(yīng)促炎刺激
（3）METTL1通過介導(dǎo)內(nèi)部m7G修飾穩(wěn)定TEAD2 mRNA
為闡明METTL1促進(jìn)急性腎臟炎癥的分子機(jī)制，研究者對順鉑刺激的對照和METTL1敲低的HK2細(xì)胞進(jìn)行了m7G MeRIP-seq和RNA-seq（圖4a）。m7G MeRIP-seq分析鑒定出1115個(gè)低甲基化和945個(gè)高甲基化peaks，這些peaks主要富集在mRNA的編碼區(qū)（CDS）鄰近起始密碼子和終止密碼子附近，并存在GA-rich motif（圖4b-d）。通路富集分析顯示，METTL1調(diào)控的m7G修飾基因與炎癥通路密切相關(guān)（圖4e）。通過整合分析，篩選出64個(gè)在METTL1敲低后同時(shí)出現(xiàn)m7G修飾降低和mRNA表達(dá)下調(diào)基因（圖4f）。經(jīng)過進(jìn)一步功能篩選，鑒定出轉(zhuǎn)錄因子TEAD2為METTL1的關(guān)鍵下游靶標(biāo)。
m7G MeRIP-seq圖譜和MeRIP-qPCR驗(yàn)證均顯示，在順鉑或H/R刺激下，TEAD2 mRNA上的m7G修飾顯著增加，而METTL1敲低則特異性降低這些修飾（圖4g-i）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明，METTL1對TEAD2表達(dá)的調(diào)控依賴于其mRNA上的特定m7G修飾位點(diǎn)（圖4j）。進(jìn)一步機(jī)制研究表明，METTL1敲低縮短TEAD2 mRNA半衰期（圖4l）。先前研究表明內(nèi)部m7G結(jié)合蛋白Quaking（QKI）與TEAD2 mRNA結(jié)合，且QKI敲低會(huì)降低TEAD2的穩(wěn)定性和表達(dá)（圖4m-o）。因此，上述研究結(jié)果揭示METTL1通過催化TEAD2 mRNA的內(nèi)部m7G修飾，經(jīng)由QKI依賴性方式增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而上調(diào)TEAD2蛋白水平。
圖4：TEAD2作為METTL1介導(dǎo)的m7G甲基化的靶標(biāo)，其機(jī)制依賴于QKI
(a) m7G MeRIP-seq實(shí)驗(yàn)流程示意圖。(b) m7G MeRIP-seq鑒定出的差異甲基化基因火山圖。
(c) m7G peaks在轉(zhuǎn)錄本上的分布Metagene圖。
(d) m7G peaks富集的序列motifs。
(e) METTL1介導(dǎo)的m7G修飾基因的KEGG通路富集分析。
(f) 低甲基化與下調(diào)基因之間的重疊分析熱圖。
(g) TEAD2 mRNA內(nèi)部m7G甲基化位點(diǎn)可視化圖。
(h-i) MeRIP-qPCR分析順鉑和缺氧/復(fù)氧處理的HK2細(xì)胞TEAD2 mRNA的m7G修飾水平。
(j) METTL1敲低的順鉑處理HK2細(xì)胞，對野生型和突變型TEAD2報(bào)告基因進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。
(k) Western blot分析METTL1敲低和TEAD2過表達(dá)的順鉑處理HK2細(xì)胞的TEAD2和p-P65蛋白水平。
(l) 在METTL1敲低的順鉑處理HK2細(xì)胞中，進(jìn)行TEAD2 mRNA的RNA衰減實(shí)驗(yàn)。
(m) 在順鉑處理的HK2細(xì)胞中，通過RIP實(shí)驗(yàn)評估QKI與TEAD2 mRNA的結(jié)合。
(n) 在QKI敲低的順鉑處理HK2細(xì)胞中，通過實(shí)時(shí)定量PCR分析TEAD2 mRNA水平。
(o) 在QKI敲低的順鉑處理HK2細(xì)胞中，進(jìn)行TEAD2 mRNA的RNA衰減實(shí)驗(yàn)。
（4）TEAD2沉默減輕METTL1介導(dǎo)的腎損傷和炎癥
為驗(yàn)證TEAD2作為METTL1下游效應(yīng)分子的功能，研究者進(jìn)行一系列功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。免疫熒光顯示，在AKI小鼠的受損腎小管中，TEAD2表達(dá)在TECs核內(nèi)顯著上調(diào)（圖5a）。在HK2細(xì)胞中敲低TEAD2能有效抑制順鉑或H/R誘導(dǎo)的NF-κB活化和炎癥因子表達(dá)（圖5b-c）。
在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過腎盂注射攜帶Ksp-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Tead2 shRNA的AAV9病毒，實(shí)現(xiàn)腎小管特異性Tead2敲低，可顯著改善順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠的腎功能、組織損傷和炎癥反應(yīng)（圖5d-h）。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠中QKI蛋白與Tead2 mRNA互作（圖5i）。最重要的功能挽救實(shí)驗(yàn)顯示，在Mettl1flox/floxGgt-Cre小鼠中恢復(fù)TEAD2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Mettl1缺失對順鉑誘導(dǎo)AKI的腎臟保護(hù)作用，重新加重腎損傷和炎癥（圖5j-l）。證實(shí)TEAD2是METTL1下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子。
圖5：TEAD2沉默在體內(nèi)外減輕腎臟損傷和炎癥。
（5）TEAD2介導(dǎo)的ACADM抑制損害線粒體功能
既往研究報(bào)道TEAD2在腫瘤中作為代謝酶的轉(zhuǎn)錄抑制因子，研究者深入探索TEAD2如何導(dǎo)致線粒體功能障礙。通過生物信息學(xué)預(yù)測和ChIP-qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TEAD2能直接結(jié)合到中鏈�；o酶A脫氫酶（ACADM）基因的啟動(dòng)子區(qū)域（圖6a）。ACADM是線粒體脂肪酸β-氧化（FAO）的關(guān)鍵限速酶。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定TEAD2結(jié)合的具體序列，并證實(shí)TEAD2過表達(dá)會(huì)抑制ACADM的啟動(dòng)子活性（圖6b）。在AKI模型中，ACADM表達(dá)被抑制，而Mettl1敲除可恢復(fù)其表達(dá)，這種恢復(fù)效應(yīng)可被TEAD2過表達(dá)所抵消（圖6c-d）。
具體而言，METTL1敲低能改善順鉑刺激的HK2細(xì)胞的線粒體耗氧率（OCR）、膜電位，并緩解線粒體碎片化，而TEAD2過表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了這些保護(hù)效應(yīng)（圖6e-h）。在動(dòng)物模型中，Mettl1敲除小鼠的腎臟表現(xiàn)出更高的ATP水平、mtDNA拷貝數(shù)、線粒體生物發(fā)生標(biāo)志物TFAM，更完整的線粒體超微結(jié)構(gòu)，以及脂質(zhì)堆積減少（圖6i-l）。上述研究結(jié)果闡明了“METTL1上調(diào)→EAD2 mRNA穩(wěn)定→TEAD2蛋白增加→抑制ACADM轉(zhuǎn)錄→FAO受損→線粒體功能障礙→促進(jìn)炎癥”的致病軸。
圖6：METTL1/TEAD2軸通過抑制ACADM轉(zhuǎn)錄破壞脂肪酸氧化并促進(jìn)線粒體功能障礙
（6）Mettl1敲低對腎臟炎癥的保護(hù)作用
基于上述機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了兩種干預(yù)策略。
tFNA-siMettl1納米遞送系統(tǒng)：研究團(tuán)隊(duì)利用具有良好生物相容性和組織穿透性的四面體框架核酸（tFNA）作為載體，裝載靶向Mettl1的siRNA，構(gòu)建了tFNA-siMettl1復(fù)合體。體內(nèi)成像顯示該復(fù)合體能高效靶向蓄積于腎臟。在順鉑或CLP誘導(dǎo)的AKI小鼠模型中，預(yù)防性給予tFNA-siMettl1，能有效降低腎臟m7G水平、METTL1和TEAD2表達(dá)，恢復(fù)ACADM水平，從而顯著改善腎功能、減輕組織病理損傷、抑制炎癥，并保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果證明基于核酸納米技術(shù)的基因治療策略在AKI中的可行性。
METTL1小分子抑制劑AZD1080：研究團(tuán)隊(duì)同步探索了小分子藥物干預(yù)策略。通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選和細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，鑒定出AZD1080作為一種新型METTL1抑制劑。分子對接和結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)其與METTL1直接互作。在細(xì)胞模型中，AZD1080能以劑量依賴方式抑制損傷誘導(dǎo)的m7G水平升高、NF-κB活化和炎癥。在動(dòng)物模型中，無論是預(yù)防性給藥（在AKI誘導(dǎo)前）還是治療性給藥（在AKI誘導(dǎo)后），AZD1080都能劑量依賴性降低m7G修飾，改善腎功能和腎臟病理，下調(diào)TEAD2并上調(diào)ACADM，且未觀察到明顯器官毒性。這為開發(fā)靶向METTL1的口服小分子藥物提供了先導(dǎo)化合物和概念驗(yàn)證。
結(jié)論和啟示
本研究通過MeRIP-seq、RNA-seq分子機(jī)制探索及體內(nèi)外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)綜合揭示了腎小管上皮細(xì)胞中METTL1是急性腎炎癥的關(guān)鍵致病因子。METTL1通過介導(dǎo)TEAD2 mRNA的內(nèi)部m7G修飾增強(qiáng)其穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制ACADM依賴性脂肪酸氧化，導(dǎo)致線粒體功能障礙并加劇炎癥反應(yīng)。此外，靶向METTL1/TEAD2/ACADM軸（tFNA-siRNA納米遞送/小分子抑制劑AZD1080），均能有效緩解腎臟驗(yàn)證。
m7G MeRIP-seq在本研究中的重要作用
m7G MeRIP-seq通過特異性抗m7G抗體免疫沉淀結(jié)合高通量測序，首次在AKI細(xì)胞模型中系統(tǒng)鑒定了1115個(gè)低甲基化和945個(gè)高甲基化peaks，明確了m7G修飾在編碼序列（CDS）區(qū)域的分布特征及GA-rich motif的富集規(guī)律，為后續(xù)靶基因篩選提供了大數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。并通過整合RNA-seq多組學(xué)數(shù)據(jù)篩選出TEAD2作為METTL1的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)，為機(jī)制驗(yàn)證提供特異性位點(diǎn)信息。
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