ChIP-seq+WGBS等分析揭示植物REM轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建DNA甲基化譜的分子機制
近日，浙江大學/加州大學洛杉磯分校吳忠壽研究員為第一作者，加州大學洛杉磯分校Steven E. Jacobsen院士為通訊作者，在《Nature Cell Biology》（IF19.1/Q1）發(fā)表題為“REM transcription factors and GDE1 shape the DNA methylation landscape through the recruitment of RNA polymerase IV transcription complexes”的研究論文，揭示了植物生殖分生組織（REM）轉(zhuǎn)錄因子和GDE1蛋白在招募Pol Ⅳ復合體以產(chǎn)生siRNA和指導特定基因組位點DNA甲基化中的關(guān)鍵分子機制。
研究綜合運用染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）、全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、小RNA測序（sRNA-seq）、IP-MS質(zhì)譜等分析，在擬南芥中首次鑒定出一條全新RNA介導DNA甲基化（RdDM）通路調(diào)控機制：生殖分生組織（REM）家族特異性表達的轉(zhuǎn)錄因子（VDD、VAL、REM12、REM13）能夠與GDE1蛋白協(xié)作，通過識別基因組上特定DNA 的motif序列（CLSY3/CLSY4 motif 1），將植物特有的RNA聚合酶IV（Pol IV）轉(zhuǎn)錄復合體精準招募到靶位點（雌性生殖組織中的siren位點）。Pol IV招募導致序列特異性24-nt siRNA產(chǎn)生，進而通過經(jīng)典的RdDM通路建立特定區(qū)域DNA甲基化。本研究揭示了特異性轉(zhuǎn)錄因子與siRNA產(chǎn)生及DNA甲基化調(diào)控之間的直接關(guān)聯(lián)，為表觀遺傳模式的遺傳調(diào)控提供了新見解。
英文標題：REM transcription factors and GDE1 shape the DNA methylation landscape through the recruitment of RNA polymerase IV transcription complexes
中文標題：REM轉(zhuǎn)錄因子和GDE1通過招募RNA聚合酶IV轉(zhuǎn)錄復合體，構(gòu)建DNA甲基化譜
發(fā)表時間：2025年6月27日
發(fā)表期刊：Nature Cell Biology
影響因子：IF19.1/Q1
技術(shù)平臺：ChIP-seq、WGBS、RNA-seq等
DOI:10.1038/s41556-025-01691-0
易小結(jié)
本研究鑒定出不同于“表觀遺傳模式主要基于染色質(zhì)特征（如H3K9甲基化）自我維持”的經(jīng)典模式，發(fā)現(xiàn)了序列特異性轉(zhuǎn)錄因子直接編碼DNA甲基化圖譜的新機制，為理解植物發(fā)育與環(huán)境應答中表觀遺傳模式的時空特異性編程提供了關(guān)鍵線索。
該研究基于WGBS與ChIP-seq的聯(lián)合分析，完整呈現(xiàn)“轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合→復合體招募→siRNA產(chǎn)生→DNA甲基化建立”因果圖譜，為跨物種表觀基因組學研究提供可參考的技術(shù)框架，并為作物雜交育種的甲基化模式提供了方法學基礎(chǔ)。
易基因相關(guān)拓展性產(chǎn)品案例
（1）植物材料和突變體構(gòu)建
轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建：Col-0擬南芥為對照，構(gòu)建帶有FLAG或Myc標簽的十幾種蛋白過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。
突變體材料：
（1）GDE1編碼一個位于RdDM位點的未表征蛋白
研究團隊通過IP-MS篩選與RdDM通路相關(guān)蛋白MORC7互作的未知蛋白，鑒定并命名新蛋白為GDE1 (GENETICS DETERMINES EPIGENETICS 1)。利用ChIP-seq技術(shù)分析其在花組織的基因組結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)GDE1與RdDM通路的多個核心組分中強共定位（圖1a-c）。motif（基序）富集分析顯示，GDE1的結(jié)合peak中存在一個保守DNA基序，該基序與之前報道的CLSY3偏好基序一致，且GDE1表達模式也與主要在花組織中表達的CLSY3/4高度相似（圖1d-f）。上述結(jié)果共同確立GDE1為RdDM通路中一個未知的、與CLSY3/4協(xié)同作用的核定位蛋白，其結(jié)合位點具有序列特異性。
圖1：GDE1是一個RdDM蛋白，并與Pol IV招募因子CLSY3/4共定位。
a-b. Meta圖和熱圖顯示GDE1的ChIP-seq信號在Pol IV（n=5,077）（a）和Pol V（n=16,327）（b）結(jié)合位點上的富集情況。
c. MORC7、Pol IV、Pol V和GDE1 ChIP-seq在代表性位點的截圖。
d. TomTom分析顯示CLSY3與GDE1結(jié)合motif的相似性。
e-f. Meta圖和熱圖顯示GDE1的ChIP-seq信號在CLSY3（n=380）（e）和CLSY4（n=1,368）（f）結(jié)合位點上的富集情況。
（2）GDE1指導CLSY3/4-Pol IV復合體調(diào)控siRNA產(chǎn)生
研究團隊首先在胚珠組織中鑒定了753個CLSY3/4依賴的siRNA位點，且在clsy3clsy4雙突變體中表達下調(diào)。為驗證GDE1是否影響siRNA產(chǎn)生，研究團隊在gde1-1突變體胚珠組織中進行了sRNA-seq。研究將依賴于CLSY3/4的siRNA位點根據(jù)在gde1-1中變化分為三組：Group 1（57%，siRNA減少）、Group 2（35%，siRNA增加）和Group 3（8%，不變）（圖2a-c）。
關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是，CLSY3/4和Pol IV的ChIP-seq信號在Group 1位點（常染色質(zhì)區(qū)域，siren位點）上，于gde1-1背景下顯著減弱；在Group 2位點（異染色質(zhì)區(qū)域）上，卻出現(xiàn)了增強（圖2d）。GDE1自身的ChIP-seq信號在Group 1位點最強，Group 2位點最弱（圖2e）。功能回補實驗表明，GDE1-3FLAG轉(zhuǎn)基因可完全恢復Group 1位點的siRNA水平（圖2b-c），證實表型特異性。上述結(jié)果說明GDE1優(yōu)先調(diào)控常染色質(zhì)區(qū)的siRNA產(chǎn)生，并與異染色質(zhì)區(qū)Pol IV招募存在競爭關(guān)系。
圖2：GDE1定位于CLSY3/CLSY4依賴性siRNA位點子集以促進siRNA產(chǎn)生，而GDE1缺失會將CLSY3/4–Pol IV復合體重定位至其他位點。
d. Meta圖顯示在野生型(WT)和gde1-1背景下，CLSY3/4和Pol IV的ChIP-seq信號在三組CLSY3/CLSY4依賴性位點上的富集情況。
e. Meta圖展示了GDE1的ChIP-seq信號在三組CLSY3/CLSY4依賴性位點上的富集情況。
f. 圈圖顯示Group 1和2中CLSY3/CLSY4依賴性siRNA在所有五條染色體上的富集分布。
（3）GDE1與REM家族轉(zhuǎn)錄因子共定位
為探究GDE1如何發(fā)揮作用，研究人員對GDE1-3FLAG進行IP-MS分析，意外發(fā)現(xiàn)未富集到CLSY3/4-Pol IV組分，反而鑒定出多個REM轉(zhuǎn)錄因子家族成員（VDD、VAL、REM46等）（圖3a）。隨后，研究團隊對VDD、VAL、REM19、REM22、REM8進行9myc標簽ChIP-seq分析證實，四個REM轉(zhuǎn)錄因子（VDD, VAL, REM12, REM13）在Group 1位點存在顯著且相似的富集（圖3b-e、g），而另一些REM因子（如REM8）主要富集于Group 2位點（圖3b-d、h）。進一步的IP-MS實驗從VDD下拉獲得了GDE1、CLSY3、Pol IV組分，證實了在體內(nèi)存在由這些因子形成的復合體（圖3f）。這些結(jié)果表明，REM家族轉(zhuǎn)錄因子（VDD/VAL/REM12/REM13/REM19為主，REM8/REM22為輔）與GDE1協(xié)同作用，負責識別特定DNA序列并與CLSY3/4-Pol IV復合體結(jié)合。
（4）GDE1在Siren位點調(diào)控siRNA產(chǎn)生與DNA甲基化
胚珠組織中主要的siRNA在Siren位點，86%的Siren位點含有CLSY3CLSY4 motif 1。研究團隊發(fā)現(xiàn)VDD/VAL/REM13等REM轉(zhuǎn)錄因子和GDE1、CLSY3/4、Pol IV在該位點的ChIP-seq信號顯著富集（圖4a-b）。具體而言，在gde1-1突變體的胚珠組織中，siren位點的24-nt siRNA水平急劇下降，表型與clsy3clsy4雙突變體相似。
研究人員應用WGBS分析了其DNA甲基化水平的變化，發(fā)現(xiàn)由于siRNA缺失，Siren位點的CHH和CHG甲基化水平在gde1-1中顯著降低，模式與clsy3clsy4一致（圖4d），這直接將GDE1介導的上游招募事件與最終的表觀遺傳修飾（DNA甲基化）降低相關(guān)聯(lián)，完成了從“序列識別”到“甲基化缺失”的表型鏈驗證。
ChIP-seq比較揭示，gde1-1中CLSY3/4和Pol IV在Siren位點的占用丟失，但在非Siren位點無變化，說明GDE1特異性穩(wěn)定Pol IV復合體于Siren位點。
（5）REM轉(zhuǎn)錄因子正向調(diào)控siRNA產(chǎn)生
為直接驗證REM轉(zhuǎn)錄因子的功能，研究團隊構(gòu)建了vdd單突變以及rem46/val/rem12三突變體。sRNA-seq分析顯示，三突變體胚珠組織中Siren位點siRNA顯著下調(diào)（圖4e-f），與clsy3 clsy4雙突變的表型在Group 1有相當程度的重合（圖4g），表明GDE1依賴REM轉(zhuǎn)錄因子以介導siRNA產(chǎn)生。
（6）RBHG結(jié)構(gòu)域在GDE1功能中至關(guān)重要
通過蛋白結(jié)構(gòu)預測，研究團隊發(fā)現(xiàn)GDE1的一個α螺旋區(qū)域（包含保守的RBHG基序）被預測與REM轉(zhuǎn)錄因子形成廣泛的氫鍵和π鍵相互作用（圖5a-c）。為驗證這一發(fā)現(xiàn)，研究團隊將此區(qū)域內(nèi)三個關(guān)鍵氨基酸位點（E251A/Y252A/Y255A）突變后進行轉(zhuǎn)基因功能回補實驗。結(jié)果表明，雖然該突變體GDE1表達正常，但無法完全挽救gde1-1突變體中siren位點的siRNA缺失表型（圖5d），Siren位點siRNA恢復程度顯著低于野生型GDE1。上述結(jié)果表明該α螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕DE1與REM轉(zhuǎn)錄因子的互作及其功能不可或缺，為復合體組裝提供了分子層面的結(jié)構(gòu)證據(jù)。
（7）REM-GDE1介導CLSY3/4-Pol IV復合體的單向轉(zhuǎn)錄
對motif分析發(fā)現(xiàn)，CLSY3/4 motif 1由2-3個重復的TTTTGCTTAT序列組成�；蚪M中具有這種結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生顯著ChIP信號的位點很少（二重復約48個，三重復約38個）。ChIP-seq分析顯示，所有復合體組分都在這些位點富集，且REM-GDE1的peak中心位于基序中心，而CLSY3/4和Pol IV的峰則偏離中心約200-300 bp，且僅位于基序某一側(cè)（圖6a、c）。這表明REM-GDE1結(jié)合在DNA基序中心，然后招募CLSY3/4-Pol IV復合體，Pol IV隨后將從基序一側(cè)或另一側(cè)起始單向轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生pre-siRNA（圖6d）。DAP-seq實驗進一步在體外驗證VDD-VAL-GDE1復合體只結(jié)合單堿基間隔的基序（圖6b）。
（8）REM8識別CLSY3/4 Motif 2以在GDE1缺失時介導siRNA產(chǎn)生
此前結(jié)果顯示Group 2位點在gde1-1中siRNA上調(diào)。研究團隊聚焦在Group 2富集的REM8，發(fā)現(xiàn)其不結(jié)合CLSY3/4 motif 1，而是識別AAGCGGAT三重復序列（命名為CLSY3/4 motif 2）（圖7b）。在gde1-1中，REM8結(jié)合的非Siren區(qū)域siRNA水平升高，且CLSY3/4和Pol IV占用增強（圖7a），表明GDE1缺失釋放的Pol IV復合體被REM8重定位至Group 2位點。
此外，CLSY3/4 motif 2位點的siRNA在clsy3clsy4中下降，在gde1-1中上升（圖7c），證實這些位點確實受CLSY3/4-Pol IV調(diào)控，但招募機制不同于Siren位點。這表明REM8（可能與其他未知因子一起）也介導了對另一類DNA基序的識別和CLSY3/4-Pol IV的招募，是GDE1依賴路徑之外的另一種序列特異性招募機制。
值得注意的是，雖然雄性組織中大多數(shù)REM轉(zhuǎn)錄因子表達量很低，但GDE1表達卻非常高。在花藥組織中，約一半的CLSY3/4依賴性siRNA位點在gde1-1中也表現(xiàn)出類似下調(diào)（圖7d-f）。上述發(fā)現(xiàn)揭示GDE1在胚珠組織中與REM因子協(xié)作，在花藥中可能與其他因子協(xié)作，實現(xiàn)組織特異性甲基化圖譜的精準編程。
圖7：GDE1缺失條件下，REM8將Pol IV復合體重新定位至CLSY34 motif 2位點，且GDE1是花藥中siRNA產(chǎn)生必需
結(jié)論和啟示
本研究首次發(fā)現(xiàn)并闡明了一個由生殖特異性REM轉(zhuǎn)錄因子與GDE1蛋白協(xié)作，通過識別特定DNA基序，直接招募Pol IV轉(zhuǎn)錄復合體，從而在特定基因組位點（如siren位點）啟動siRNA產(chǎn)生和DNA甲基化的全新遺傳和表觀遺傳關(guān)聯(lián)通路。
ChIP-seq與WGBS在本研究中的重要作用
ChIP-seq通過對12種蛋白的精確定位，繪制了REM-GDE1-CLSY3/4-Pol IV的共定位網(wǎng)絡；通過比較野生型與突變體，揭示了復合體的動態(tài)重定位；通過peak偏移分析，推斷單向轉(zhuǎn)錄模型。
WGBS在siRNA產(chǎn)生后，直接單堿基分辨率檢測DNA甲基化（CHG/CHH）修飾水平，從功能層面確認該通路的生物學結(jié)果。
WGBS與ChIP-seq的聯(lián)合使用，使得從“蛋白定位”到“功能輸出”的因果鏈條完整閉合，是揭示新機制的黃金標準。
參考文獻：Wu Z, Xue Y, Wang S, Shih YH, Zhong Z, Feng S, Draper J, Lu A, Hoeke CA, Sha J, Li L, Wohlschlegel J, Wu K, Jacobsen SE. REM transcription factors and GDE1 shape the DNA methylation landscape through the recruitment of RNA polymerase IV transcription complexes. Nat Cell Biol. 2025 Jun 27. doi: 10.1038/s41556-025-01691-0.
研究綜合運用染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）、全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、小RNA測序（sRNA-seq）、IP-MS質(zhì)譜等分析，在擬南芥中首次鑒定出一條全新RNA介導DNA甲基化（RdDM）通路調(diào)控機制：生殖分生組織（REM）家族特異性表達的轉(zhuǎn)錄因子（VDD、VAL、REM12、REM13）能夠與GDE1蛋白協(xié)作，通過識別基因組上特定DNA 的motif序列（CLSY3/CLSY4 motif 1），將植物特有的RNA聚合酶IV（Pol IV）轉(zhuǎn)錄復合體精準招募到靶位點（雌性生殖組織中的siren位點）。Pol IV招募導致序列特異性24-nt siRNA產(chǎn)生，進而通過經(jīng)典的RdDM通路建立特定區(qū)域DNA甲基化。本研究揭示了特異性轉(zhuǎn)錄因子與siRNA產(chǎn)生及DNA甲基化調(diào)控之間的直接關(guān)聯(lián)，為表觀遺傳模式的遺傳調(diào)控提供了新見解。
英文標題：REM transcription factors and GDE1 shape the DNA methylation landscape through the recruitment of RNA polymerase IV transcription complexes
中文標題：REM轉(zhuǎn)錄因子和GDE1通過招募RNA聚合酶IV轉(zhuǎn)錄復合體，構(gòu)建DNA甲基化譜
發(fā)表時間：2025年6月27日
發(fā)表期刊：Nature Cell Biology
影響因子：IF19.1/Q1
技術(shù)平臺：ChIP-seq、WGBS、RNA-seq等
DOI:10.1038/s41556-025-01691-0
易小結(jié)
本研究鑒定出不同于“表觀遺傳模式主要基于染色質(zhì)特征（如H3K9甲基化）自我維持”的經(jīng)典模式，發(fā)現(xiàn)了序列特異性轉(zhuǎn)錄因子直接編碼DNA甲基化圖譜的新機制，為理解植物發(fā)育與環(huán)境應答中表觀遺傳模式的時空特異性編程提供了關(guān)鍵線索。
該研究基于WGBS與ChIP-seq的聯(lián)合分析，完整呈現(xiàn)“轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合→復合體招募→siRNA產(chǎn)生→DNA甲基化建立”因果圖譜，為跨物種表觀基因組學研究提供可參考的技術(shù)框架，并為作物雜交育種的甲基化模式提供了方法學基礎(chǔ)。
易基因相關(guān)拓展性產(chǎn)品案例
- 項目文章｜Plant Physiol：鄭州果樹所王力榮團隊ChIP-seq等揭示桃樹需冷量和芽休眠調(diào)控的關(guān)鍵基因
- 項目文章 | Nature子刊：ChIP-seq等揭示c-di-AMP與DasR互作以調(diào)控細菌生長、發(fā)育和抗生素合成
- 項目文章｜Plant Cell Environ：WGBS+RNA-seq助力揭示植物不定根再生的DNA甲基化調(diào)控機制
- 項目文章｜DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析助力揭示花青素生物合成調(diào)控柑橘果實品質(zhì)的表觀新機制
- 項目文章|NG (IF29)：顛覆認知！深圳仙湖植物園劉陽團隊WGBS及超級泛基因組分析揭示苔蘚植物基因家族比維管植物更豐富
- 項目文章｜WGBS+RNA-seq揭示AtSAMS通過DNA甲基化和乙烯信號通路協(xié)同調(diào)控植物花器官發(fā)育的表觀遺傳機制
（1）植物材料和突變體構(gòu)建
轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建：Col-0擬南芥為對照，構(gòu)建帶有FLAG或Myc標簽的十幾種蛋白過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。
突變體材料：
- gde1-1（SALKseq_10069.1）：GDE1基因T-DNA插入缺失突變體
- clsy3-1（SALK_040366）和clsy4-1（SALK_003876）：Pol IV招募因子雙突變體
- rem46/val/rem12三突變體：通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時敲除三個串聯(lián)重復的REM基因（REM46、VAL、REM12），產(chǎn)生部分功能喪失
- rem8-cr：REM8基因CRISPR敲除突變體
- 免疫沉淀-質(zhì)譜(IP-MS)：鑒定GDE1或VDD的互作蛋白。
- 蛋白質(zhì)印跡與Co-IP：驗證IP-MS結(jié)果，并更靈敏檢測復合體組分間的互作。
- ChIP-seq：約2g花組織，對GDE1-3FLAG、CLSY3-9myc、CLSY4-9myc、Pol IV-9myc、VDD/VAL/REM13/REM19/REM22/REM8-9myc、VDD-3FLAG等12種蛋白標簽抗體進行ChIP-seq，繪制全基因組蛋白結(jié)合圖譜。
- WGBS：計算各序列背景下（CG, CHG, CHH）的C/(C+T)比率，獲得全基因組甲基化水平。直接量化gde1-1和clsy3clsy4突變體中Siren位點的CHG和CHH甲基化喪失，從功能層面證實REM-GDE1-CLSY3/4通路對非CG甲基化的依賴性。
- 小RNA測序(sRNA-seq)：胚珠組織或花藥樣本，鑒定各突變體中的siRNA位點。
- DNA親和純化測序(DAP-seq)：野生型花蕾樣本，驗證體外直接結(jié)合能力和序列特異性。
（1）GDE1編碼一個位于RdDM位點的未表征蛋白
研究團隊通過IP-MS篩選與RdDM通路相關(guān)蛋白MORC7互作的未知蛋白，鑒定并命名新蛋白為GDE1 (GENETICS DETERMINES EPIGENETICS 1)。利用ChIP-seq技術(shù)分析其在花組織的基因組結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)GDE1與RdDM通路的多個核心組分中強共定位（圖1a-c）。motif（基序）富集分析顯示，GDE1的結(jié)合peak中存在一個保守DNA基序，該基序與之前報道的CLSY3偏好基序一致，且GDE1表達模式也與主要在花組織中表達的CLSY3/4高度相似（圖1d-f）。上述結(jié)果共同確立GDE1為RdDM通路中一個未知的、與CLSY3/4協(xié)同作用的核定位蛋白，其結(jié)合位點具有序列特異性。
a-b. Meta圖和熱圖顯示GDE1的ChIP-seq信號在Pol IV（n=5,077）（a）和Pol V（n=16,327）（b）結(jié)合位點上的富集情況。
c. MORC7、Pol IV、Pol V和GDE1 ChIP-seq在代表性位點的截圖。
d. TomTom分析顯示CLSY3與GDE1結(jié)合motif的相似性。
e-f. Meta圖和熱圖顯示GDE1的ChIP-seq信號在CLSY3（n=380）（e）和CLSY4（n=1,368）（f）結(jié)合位點上的富集情況。
（2）GDE1指導CLSY3/4-Pol IV復合體調(diào)控siRNA產(chǎn)生
研究團隊首先在胚珠組織中鑒定了753個CLSY3/4依賴的siRNA位點，且在clsy3clsy4雙突變體中表達下調(diào)。為驗證GDE1是否影響siRNA產(chǎn)生，研究團隊在gde1-1突變體胚珠組織中進行了sRNA-seq。研究將依賴于CLSY3/4的siRNA位點根據(jù)在gde1-1中變化分為三組：Group 1（57%，siRNA減少）、Group 2（35%，siRNA增加）和Group 3（8%，不變）（圖2a-c）。
關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是，CLSY3/4和Pol IV的ChIP-seq信號在Group 1位點（常染色質(zhì)區(qū)域，siren位點）上，于gde1-1背景下顯著減弱；在Group 2位點（異染色質(zhì)區(qū)域）上，卻出現(xiàn)了增強（圖2d）。GDE1自身的ChIP-seq信號在Group 1位點最強，Group 2位點最弱（圖2e）。功能回補實驗表明，GDE1-3FLAG轉(zhuǎn)基因可完全恢復Group 1位點的siRNA水平（圖2b-c），證實表型特異性。上述結(jié)果說明GDE1優(yōu)先調(diào)控常染色質(zhì)區(qū)的siRNA產(chǎn)生，并與異染色質(zhì)區(qū)Pol IV招募存在競爭關(guān)系。
圖2：GDE1定位于CLSY3/CLSY4依賴性siRNA位點子集以促進siRNA產(chǎn)生，而GDE1缺失會將CLSY3/4–Pol IV復合體重定位至其他位點。
- 餅圖顯示三組CLSY3/CLSY4依賴性siRNA位點的百分比分布。
d. Meta圖顯示在野生型(WT)和gde1-1背景下，CLSY3/4和Pol IV的ChIP-seq信號在三組CLSY3/CLSY4依賴性位點上的富集情況。
e. Meta圖展示了GDE1的ChIP-seq信號在三組CLSY3/CLSY4依賴性位點上的富集情況。
f. 圈圖顯示Group 1和2中CLSY3/CLSY4依賴性siRNA在所有五條染色體上的富集分布。
（3）GDE1與REM家族轉(zhuǎn)錄因子共定位
為探究GDE1如何發(fā)揮作用，研究人員對GDE1-3FLAG進行IP-MS分析，意外發(fā)現(xiàn)未富集到CLSY3/4-Pol IV組分，反而鑒定出多個REM轉(zhuǎn)錄因子家族成員（VDD、VAL、REM46等）（圖3a）。隨后，研究團隊對VDD、VAL、REM19、REM22、REM8進行9myc標簽ChIP-seq分析證實，四個REM轉(zhuǎn)錄因子（VDD, VAL, REM12, REM13）在Group 1位點存在顯著且相似的富集（圖3b-e、g），而另一些REM因子（如REM8）主要富集于Group 2位點（圖3b-d、h）。進一步的IP-MS實驗從VDD下拉獲得了GDE1、CLSY3、Pol IV組分，證實了在體內(nèi)存在由這些因子形成的復合體（圖3f）。這些結(jié)果表明，REM家族轉(zhuǎn)錄因子（VDD/VAL/REM12/REM13/REM19為主，REM8/REM22為輔）與GDE1協(xié)同作用，負責識別特定DNA序列并與CLSY3/4-Pol IV復合體結(jié)合。
圖3：REM轉(zhuǎn)錄因子在CLSY3/CLSY4依賴性siRNA位點與GDE1及Pol IV復合體結(jié)合
（4）GDE1在Siren位點調(diào)控siRNA產(chǎn)生與DNA甲基化
胚珠組織中主要的siRNA在Siren位點，86%的Siren位點含有CLSY3CLSY4 motif 1。研究團隊發(fā)現(xiàn)VDD/VAL/REM13等REM轉(zhuǎn)錄因子和GDE1、CLSY3/4、Pol IV在該位點的ChIP-seq信號顯著富集（圖4a-b）。具體而言，在gde1-1突變體的胚珠組織中，siren位點的24-nt siRNA水平急劇下降，表型與clsy3clsy4雙突變體相似。
研究人員應用WGBS分析了其DNA甲基化水平的變化，發(fā)現(xiàn)由于siRNA缺失，Siren位點的CHH和CHG甲基化水平在gde1-1中顯著降低，模式與clsy3clsy4一致（圖4d），這直接將GDE1介導的上游招募事件與最終的表觀遺傳修飾（DNA甲基化）降低相關(guān)聯(lián)，完成了從“序列識別”到“甲基化缺失”的表型鏈驗證。
ChIP-seq比較揭示，gde1-1中CLSY3/4和Pol IV在Siren位點的占用丟失，但在非Siren位點無變化，說明GDE1特異性穩(wěn)定Pol IV復合體于Siren位點。
圖4：VDD/VAL/REM13–GDE1–CLSY3/4復合體定位于siren位點以產(chǎn)生siRNA。
（5）REM轉(zhuǎn)錄因子正向調(diào)控siRNA產(chǎn)生
為直接驗證REM轉(zhuǎn)錄因子的功能，研究團隊構(gòu)建了vdd單突變以及rem46/val/rem12三突變體。sRNA-seq分析顯示，三突變體胚珠組織中Siren位點siRNA顯著下調(diào)（圖4e-f），與clsy3 clsy4雙突變的表型在Group 1有相當程度的重合（圖4g），表明GDE1依賴REM轉(zhuǎn)錄因子以介導siRNA產(chǎn)生。
（6）RBHG結(jié)構(gòu)域在GDE1功能中至關(guān)重要
通過蛋白結(jié)構(gòu)預測，研究團隊發(fā)現(xiàn)GDE1的一個α螺旋區(qū)域（包含保守的RBHG基序）被預測與REM轉(zhuǎn)錄因子形成廣泛的氫鍵和π鍵相互作用（圖5a-c）。為驗證這一發(fā)現(xiàn)，研究團隊將此區(qū)域內(nèi)三個關(guān)鍵氨基酸位點（E251A/Y252A/Y255A）突變后進行轉(zhuǎn)基因功能回補實驗。結(jié)果表明，雖然該突變體GDE1表達正常，但無法完全挽救gde1-1突變體中siren位點的siRNA缺失表型（圖5d），Siren位點siRNA恢復程度顯著低于野生型GDE1。上述結(jié)果表明該α螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕DE1與REM轉(zhuǎn)錄因子的互作及其功能不可或缺，為復合體組裝提供了分子層面的結(jié)構(gòu)證據(jù)。
圖5：GDE1的RBHG結(jié)構(gòu)域?qū)iRNA產(chǎn)生至關(guān)重要
（7）REM-GDE1介導CLSY3/4-Pol IV復合體的單向轉(zhuǎn)錄
對motif分析發(fā)現(xiàn)，CLSY3/4 motif 1由2-3個重復的TTTTGCTTAT序列組成�；蚪M中具有這種結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生顯著ChIP信號的位點很少（二重復約48個，三重復約38個）。ChIP-seq分析顯示，所有復合體組分都在這些位點富集，且REM-GDE1的peak中心位于基序中心，而CLSY3/4和Pol IV的峰則偏離中心約200-300 bp，且僅位于基序某一側(cè)（圖6a、c）。這表明REM-GDE1結(jié)合在DNA基序中心，然后招募CLSY3/4-Pol IV復合體，Pol IV隨后將從基序一側(cè)或另一側(cè)起始單向轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生pre-siRNA（圖6d）。DAP-seq實驗進一步在體外驗證VDD-VAL-GDE1復合體只結(jié)合單堿基間隔的基序（圖6b）。
圖6：Pol IV轉(zhuǎn)錄復合體識別CLSY3/4 motif 1并進行單向轉(zhuǎn)錄
（8）REM8識別CLSY3/4 Motif 2以在GDE1缺失時介導siRNA產(chǎn)生
此前結(jié)果顯示Group 2位點在gde1-1中siRNA上調(diào)。研究團隊聚焦在Group 2富集的REM8，發(fā)現(xiàn)其不結(jié)合CLSY3/4 motif 1，而是識別AAGCGGAT三重復序列（命名為CLSY3/4 motif 2）（圖7b）。在gde1-1中，REM8結(jié)合的非Siren區(qū)域siRNA水平升高，且CLSY3/4和Pol IV占用增強（圖7a），表明GDE1缺失釋放的Pol IV復合體被REM8重定位至Group 2位點。
此外，CLSY3/4 motif 2位點的siRNA在clsy3clsy4中下降，在gde1-1中上升（圖7c），證實這些位點確實受CLSY3/4-Pol IV調(diào)控，但招募機制不同于Siren位點。這表明REM8（可能與其他未知因子一起）也介導了對另一類DNA基序的識別和CLSY3/4-Pol IV的招募，是GDE1依賴路徑之外的另一種序列特異性招募機制。
值得注意的是，雖然雄性組織中大多數(shù)REM轉(zhuǎn)錄因子表達量很低，但GDE1表達卻非常高。在花藥組織中，約一半的CLSY3/4依賴性siRNA位點在gde1-1中也表現(xiàn)出類似下調(diào)（圖7d-f）。上述發(fā)現(xiàn)揭示GDE1在胚珠組織中與REM因子協(xié)作，在花藥中可能與其他因子協(xié)作，實現(xiàn)組織特異性甲基化圖譜的精準編程。
圖7：GDE1缺失條件下，REM8將Pol IV復合體重新定位至CLSY34 motif 2位點，且GDE1是花藥中siRNA產(chǎn)生必需
結(jié)論和啟示
本研究首次發(fā)現(xiàn)并闡明了一個由生殖特異性REM轉(zhuǎn)錄因子與GDE1蛋白協(xié)作，通過識別特定DNA基序，直接招募Pol IV轉(zhuǎn)錄復合體，從而在特定基因組位點（如siren位點）啟動siRNA產(chǎn)生和DNA甲基化的全新遺傳和表觀遺傳關(guān)聯(lián)通路。
ChIP-seq與WGBS在本研究中的重要作用
ChIP-seq通過對12種蛋白的精確定位，繪制了REM-GDE1-CLSY3/4-Pol IV的共定位網(wǎng)絡；通過比較野生型與突變體，揭示了復合體的動態(tài)重定位；通過peak偏移分析，推斷單向轉(zhuǎn)錄模型。
WGBS在siRNA產(chǎn)生后，直接單堿基分辨率檢測DNA甲基化（CHG/CHH）修飾水平，從功能層面確認該通路的生物學結(jié)果。
WGBS與ChIP-seq的聯(lián)合使用，使得從“蛋白定位”到“功能輸出”的因果鏈條完整閉合，是揭示新機制的黃金標準。
參考文獻：Wu Z, Xue Y, Wang S, Shih YH, Zhong Z, Feng S, Draper J, Lu A, Hoeke CA, Sha J, Li L, Wohlschlegel J, Wu K, Jacobsen SE. REM transcription factors and GDE1 shape the DNA methylation landscape through the recruitment of RNA polymerase IV transcription complexes. Nat Cell Biol. 2025 Jun 27. doi: 10.1038/s41556-025-01691-0.
- DSP空間組學助力揭秘食管鱗狀細胞癌(ESCC)生態(tài)演變空間分子圖譜
- 多肽檢測方法的對比及選型
- 文獻解讀：利用WGBS驗證開發(fā)新型DNA甲基化編輯多功能分子工具箱
- 單細胞測序助力證實源自CD8+T細胞的IFN-γ為腫瘤微環(huán)境主要調(diào)節(jié)因子
- 生信分析大揭秘：4種組學常見流程與應用前景全解析
- AF6敲除上調(diào)膽汁酸分泌促進CXCL14介導的HCC抗腫瘤免疫
- 單細胞結(jié)合Xenium多模態(tài)解析中性粒細胞異質(zhì)性與空間調(diào)控機制
- WGBS等助力揭示激活植物DNA甲基化基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵蛋白結(jié)合
Copyright(C) 1998-2026 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com