Pipetty電動移液器在犬細小病毒HA試驗中的應(yīng)用

方案摘要：本方案結(jié)合了Pipetty電動移液器連續(xù)分液及自動混勻功能的優(yōu)勢，在犬細小病毒（CPV）血凝（HA）試驗中，通過規(guī)范儀器操作、實驗步驟及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，提升試驗過程中移液操作的精準(zhǔn)度、重復(fù)性與效率，確保HA試驗結(jié)果的可靠性，為犬細小病毒的快速檢測與血凝效價評估提供標(biāo)準(zhǔn)化實驗依據(jù)。
 
方案詳情：
一、實驗原理
犬細小病毒（CPV）表面含有血凝素抗原，可與豬紅細胞表面的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致豬紅細胞發(fā)生凝集反應(yīng)（HA反應(yīng)），此反應(yīng)具有特異性與劑量依賴性。
 
二、‌實驗準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty電動移液器MSI-03-250；
② 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）；
③ 恒溫培養(yǎng)箱(5℃~100℃)；
④ 微型混合器；
⑤ 96孔V形微量反應(yīng)板。
 
2、試劑和材料
① PBS；
② 1%豬紅細胞懸液；
③ CPV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；
④ 待檢CPV樣品。
三、實驗步驟
1、加樣稀釋準(zhǔn)備：取一塊96孔V形微量反應(yīng)板，通過Pipetty電動移液器的連續(xù)分液功能向第1孔至第12孔每孔等量加入25μL  PBS，確保每孔體積一致，避免氣泡產(chǎn)生。
 
2、樣品倍比稀釋：用移液器吸取經(jīng)預(yù)處理的待檢樣品25μL，加入左側(cè)第1孔中，使用Pipetty混勻功能，輕輕吹吸3-5次（或置于微型混合器振蕩5s）混合均勻；隨后從第1孔吸出25μL，轉(zhuǎn)移至第2孔，重復(fù)混合操作；按此方法依次進行倍比稀釋，直至第11孔；在第11孔混合均勻后，吸出25μL棄掉，保證第1孔至第11孔最終體積均為25μL；第12孔作為PBS空白對照孔，不加入樣品。
 
3、體系補加：通過移液器向第1孔至第12孔每孔再補加25μL PBS，使各孔反應(yīng)體系總體積達到50μL，維持反應(yīng)條件統(tǒng)一。
4、紅細胞懸液添加與反應(yīng)：由左至右依次向每孔加入25μL 1%豬紅細胞懸液，加樣后立即置于微型混合器上振蕩10s，使紅細胞與待檢樣品充分接觸混合；將反應(yīng)板平穩(wěn)放入4℃冰箱中靜置30min~60min，待PBS對照孔（第12孔）紅細胞呈顯著紐扣狀沉降時，取出反應(yīng)板觀察結(jié)果。
 
四、結(jié)果判定
將96孔V形微量反應(yīng)板傾斜,觀察紅細胞有無淚珠狀流淌。以使紅細胞100%凝集(完全無淚珠狀流淌)的最高稀釋倍數(shù)作為該病毒的血凝效價,即一個血凝單位,判定待檢樣品的病毒血凝效價。