Pipetty 電動(dòng)移液器在副豬格拉瑟菌（間接ELISA）檢測(cè)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案通過結(jié)合Pipetty電動(dòng)移液器，利用其精準(zhǔn)移液控制提升實(shí)驗(yàn)重復(fù)性與準(zhǔn)確性，保障了加樣步驟的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，減少人為操作誤差導(dǎo)致的檢測(cè)偏差，實(shí)現(xiàn)對(duì)豬臨床樣品中副豬格拉瑟菌的快速、靈敏、特異性檢測(cè)，為副豬格拉瑟菌感染的快速篩查與確診提供標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床疫病診斷與防控提供可靠技術(shù)支撐。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
間接ELISA技術(shù)基于抗原抗體特異性結(jié)合及酶催化底物顯色的原理，用于檢測(cè)樣品中針對(duì)副豬格拉瑟菌的特異性抗體。本實(shí)驗(yàn)以副豬格拉瑟菌重組P2蛋白作為包被抗原，吸附于96孔酶標(biāo)板表面；加入待檢血清后，血清中若存在副豬格拉瑟菌特異性抗體，會(huì)與板上包被抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物；再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗豬IgG酶標(biāo)抗體，該酶標(biāo)抗體可與復(fù)合物中的豬IgG特異性結(jié)合；最后加入TMB底物溶液，HRP可催化底物顯色，顯色程度與待檢血清中特異性抗體含量呈正相關(guān)。通過酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長下的吸光值，結(jié)合公式計(jì)算與判定標(biāo)準(zhǔn)，可判斷待檢樣品是否為陽性。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 酶標(biāo)儀；
③ 恒溫箱；
④ 洗板機(jī)或洗滌瓶；
⑤ 96孔酶標(biāo)板；
⑥ U形96孔稀釋板；
⑦ 貯液槽。
 
2、試劑和材料
① 包被抗原:副豬格拉瑟菌重組P2蛋白；
② 酶標(biāo)抗體:兔抗豬IgG-辣根過氧化物酶；
③ 對(duì)照:副豬格拉瑟菌抗體陽性對(duì)照(陽性血清)、陰性對(duì)照(陰性血清)；
④ 包被液、洗滌液、封閉液、樣品稀釋液、酶結(jié)合物稀釋液、終止液；
⑤ 底物溶液:商品化即用型TMB底物溶液。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、取96孔酶標(biāo)板，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，將經(jīng)包被緩沖液稀釋至工作濃度（0.5μg/mL）的副豬格拉瑟菌重組P2抗原，每孔加入100μL；置于4℃冰箱過夜（16h~22h）。棄去板中包被液，用Pipetty電動(dòng)移液器每孔加入300μL洗滌液，洗滌1次，甩掉洗滌液并在吸水紙上拍干殘留液體。每孔加入120μL封閉液，置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育2h，或4℃過夜16h~22h。封閉結(jié)束后，棄去板中的封閉液，于吸水紙上拍干，室溫干燥后置于4℃干燥保存。
 
2、在U形96孔稀釋板中，用樣品稀釋液將待檢血清、陽性對(duì)照血清及陰性對(duì)照血清分別作1:100稀釋。使用Pipetty電動(dòng)移液器連續(xù)分液模式，每孔加入100μL稀釋后的血清樣品，每個(gè)對(duì)照血清各做兩孔重復(fù)，將酶標(biāo)板置于37℃溫箱內(nèi)反應(yīng)60min。取出反應(yīng)板，棄去反應(yīng)液，用Pipetty每孔加入300μL洗滌液，洗滌5次，每次洗滌后在吸水紙上拍干。
3、用樣品稀釋液將兔抗豬IgG-辣根過氧化物酶作1:5000稀釋至工作濃度。使用Pipetty連續(xù)分液模式，每孔加入100μL稀釋后的酶標(biāo)抗體，置于37℃溫箱內(nèi)反應(yīng)30min。取出反應(yīng)板，棄去反應(yīng)液，用洗滌液每孔加300μL，洗滌3次。
4、每孔加入100μL TMB底物溶液，置于37℃溫箱內(nèi)避光反應(yīng)15min。
5、反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。
 
6、酶標(biāo)儀讀取各孔吸光值(OD_450nm，指在波長450nm的光密度值）。
四、數(shù)據(jù)分析

 
五、結(jié)果判定