Pipetty電動(dòng)移液器在犬細(xì)小病毒分離鑒定中的應(yīng)用

方案摘要：本方案利用Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)完成樣品移取、培養(yǎng)液分裝等關(guān)鍵操作，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)、樣品接種、病毒傳代及鑒定等步驟，實(shí)現(xiàn)犬細(xì)小病毒的高效分離與準(zhǔn)確鑒定，為犬細(xì)小病毒病的診斷及相關(guān)研究提供標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方法，同時(shí)凸顯Pipetty電動(dòng)移液器在提升實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)度、重復(fù)性及效率方面的優(yōu)勢。
 
方案詳情：

• 實(shí)驗(yàn)原理

犬細(xì)小病毒（CPV）可在貓腎細(xì)胞系（FK81細(xì)胞）中增殖，增殖過程中會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞出現(xiàn)特征性病變（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、拉絲、脫落等現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)通過無菌操作處理待檢樣品，利用Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移取樣品上清液接種至FK81細(xì)胞中，在適宜培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變情況。若出現(xiàn)特征性CPE，經(jīng)反復(fù)凍融、離心處理后，采用指定方法進(jìn)行病毒鑒定，從而實(shí)現(xiàn)犬細(xì)小病毒的分離與確認(rèn)。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty電動(dòng)移液器MSI-03-1000；
② 冰箱(4C、-20℃、-70℃)。
③ 二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃）。
④ 倒置顯微鏡。
⑤ 電子天平:精度0.1mg。
⑥ 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25cm2或75cm2等)。
⑦ 0.22m微孔濾器。
 
2、試劑和材料
① 試驗(yàn)用水，符合GB/T6682的規(guī)定。
② DMEM培養(yǎng)液，按照A.3配制。
③ 新生牛血清。
④ FK81細(xì)胞(貓腎細(xì)胞系)。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、使用Pipetty電動(dòng)移液器吸取6mL含8%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，精準(zhǔn)注入25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，接種FK81細(xì)胞后，置于37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至適宜密度后，即可進(jìn)行待檢樣品接種。
 
2、采用同步接種方法，通過Pipetty電動(dòng)移液器取處理好的樣品上清液1mL，經(jīng)0.22μm微孔濾器過濾除菌后，精準(zhǔn)接種于已培養(yǎng)好的FK81細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并記錄細(xì)胞病變結(jié)果，連續(xù)觀察3d~5d。
3、CPV在FK81細(xì)胞上培養(yǎng)，一般培養(yǎng)3d~5d后，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞變圓、拉絲、脫落等特征性CPE。若樣品初次接種FK81細(xì)胞后，培養(yǎng)5d仍無CPE，需用Pipetty電動(dòng)移液器吸取1mL該細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液，精準(zhǔn)移入新的FK81細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)（即第2代），繼續(xù)置于37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，每日觀察并記錄細(xì)胞病變情況。無CPE的樣品培養(yǎng)物需按上述方法盲傳5代。
 
4、若細(xì)胞在初次接種樣品或盲傳5代后出現(xiàn)特征性CPE，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶用封口膜封口，放入-70℃冰箱中凍存，取出后室溫融化，反復(fù)凍融兩次以充分釋放病毒。隨后用Pipetty電動(dòng)移液器將細(xì)胞培養(yǎng)液移入10mL離心管中，在4℃、3000r/min條件下離心20min，取上清液作為待檢樣品。采用HI/HV、PCR、熒光PCR任一方法，對(duì)上清液中的病毒進(jìn)行犬細(xì)小病毒特異性鑒定。
四、結(jié)果與報(bào)告
1、初次接種樣品或盲傳5代后出現(xiàn)CPE，并經(jīng)HI/HV、PCR、熒光PCR任一方法，檢測結(jié)果為陽性，判為CPV分離陽性。
2、初次接種樣品和盲傳5代后均未出現(xiàn)CPE，或出現(xiàn)CPE但經(jīng)過HI/HV、PCR、熒光PCR任一方法，檢測結(jié)果為陰性，判為CPV分離陰性。