Pipetty 電動(dòng)移液器在副豬格拉瑟菌（熒光實(shí)時(shí)PCR）檢測(cè)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案結(jié)合了Pipetty電動(dòng)移液器的產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)，通過(guò)精準(zhǔn)移取實(shí)驗(yàn)試劑與樣品，保障核酸提取、PCR反應(yīng)體系配制等關(guān)鍵步驟的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，減少人為操作誤差導(dǎo)致的檢測(cè)偏差，實(shí)現(xiàn)對(duì)豬臨床樣品中副豬格拉瑟菌的快速、靈敏、特異性檢測(cè)，為臨床疫病診斷與防控提供可靠技術(shù)支撐。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
副豬格拉瑟菌為革蘭氏陰性菌，是引起豬格拉瑟氏病的病原體，可導(dǎo)致豬出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、胸膜炎、腦膜炎等癥狀，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)基于熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，利用副豬格拉瑟菌特異性引物與MGB探針，針對(duì)病原體基因組中保守序列進(jìn)行靶向擴(kuò)增。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，探針與目的片段特異性結(jié)合，隨著擴(kuò)增循環(huán)進(jìn)行，熒光信號(hào)不斷累積，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中副豬格拉瑟菌的定性檢測(cè)。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 自動(dòng)化核酸提取儀；
③ 實(shí)時(shí)熒光PCR儀；
④ 臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(最大離心力12000g以上)。
 
2、試劑和材料
① 副豬格拉瑟菌實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增用上、下游引物及探針序列；
② 陽(yáng)性對(duì)照；
③ 陰性對(duì)照；
④ 核酸提取試劑盒。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、采用核酸提取試劑盒或自動(dòng)化核酸提取儀提取豬臨床樣品中的副豬格拉瑟菌DNA。提取過(guò)程中，使用Pipetty電動(dòng)移液器，精準(zhǔn)移取提取試劑及樣品，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，避免DNA降解或污染。提取完成后，若在2h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，可將DNA置于冰上臨時(shí)保存；若需長(zhǎng)時(shí)間存放，應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，防止DNA降解。
 
2、每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各3個(gè)重復(fù)孔，按以下比例配制25μL反應(yīng)體系，所有試劑均通過(guò)Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移�。�
10×PCR緩沖液（含Mg²⁺）            2.5μL
dNTPs混合物                          2.0μL                
上游引物（FQ-P1）                    0.5μL
下游引物（FQ-P2）                    0.5μL
MGB探針                              0.5μL
ExTag DNA聚合酶                      0.25μL
滅菌雙蒸水                           16.75μL
DNA模板                              2.0μL
合計(jì)                                  25μL
體系配制完成后，輕柔振蕩混勻，置于臺(tái)式低溫高速離心機(jī)中，以3000r/min離心30s，使液體全部聚集于管底，避免氣泡影響熒光信號(hào)采集。按樣品順序?qū)⒎磻?yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀樣品槽，做好標(biāo)記。
 
3、第一階段,94C預(yù)變性5min；第二階段，94C變性30s，60C延伸30s，40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)收集，熒光模式設(shè)為FAM/NONE雙標(biāo)記模式。
 
四、結(jié)果判定
1、陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)無(wú)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，且Ct值>32.0或無(wú)；陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)≤29.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)；如陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果不滿(mǎn)足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
2、Ct值≤29.0，而且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，則判定為副豬格拉瑟菌通用型陽(yáng)性。
3、Ct值>32.0或無(wú)，并且無(wú)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，則判定為副豬格拉瑟菌通用型陰性。
4、29.0