Pipetty 電動移液器在牛羊副流感cELISA檢測中的應用

方案摘要：本方案針對牛羊副流感病毒抗體cELISA檢測的精準性與高效性需求，整合Pipetty電動移液器的核心優(yōu)勢，構建標準化檢測流程。該移液器具備連續(xù)分液功能，可實現(xiàn)多孔試劑的均勻精準分配；其自動記憶六次分液程序一鍵調(diào)節(jié)分液次數(shù)的特性，能大幅簡化手動調(diào)節(jié)分液量的操作，減少人為誤差與操作耗時。方案通過補足實驗原理、優(yōu)化操作步驟，明確借助該移液器完成樣品稀釋、加樣、抗體添加等關鍵環(huán)節(jié)，結(jié)合cELISA競爭結(jié)合機制實現(xiàn)抗體定性檢測，為牛羊副流感疫病的快速篩查、流行病學監(jiān)測提供穩(wěn)定可靠的技術支撐，提升基層實驗室與規(guī)模化檢疫的檢測效率。
 
方案詳情：

• 實驗原理

通過抗原抗體特異性競爭結(jié)合反應實現(xiàn)牛羊副流感病毒抗體的檢測。預先將牛羊副流感病毒抗原包被于酶標板孔內(nèi)，當加入待檢血清后，血清中若存在副流感病毒特異性抗體，會優(yōu)先與包被抗原結(jié)合形成抗原-抗體復合物；隨后加入的酶標單克隆抗體（競爭抗體），將因包被抗原結(jié)合位點被占據(jù)而無法有效結(jié)合，且待檢血清中特異性抗體濃度越高，對酶標單克隆抗體結(jié)合的抑制作用越強。加入TMB底物顯色液后，酶標單克隆抗體上的酶可催化底物發(fā)生顯色反應，其顯色強度與酶標單克隆抗體的結(jié)合量正相關。通過酶標儀讀取450nm波長下的OD值，依據(jù)公式計算血清阻斷率（PI），即可判定待檢血清中抗體的陽性/陰性狀態(tài)。
 
二、‌實驗準備
1、儀器設配
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸頭；
② 臺式離心機；
③ 往復式微量振蕩器；
④ 渦旋混合振蕩器；
④ 酶標儀；
⑤ 洗板機；
⑥ 恒溫培養(yǎng)箱；
⑦ 冰箱(2-8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)；
 
2、試劑和材料
① 樣品稀釋緩沖液；
② 20倍濃縮洗滌液；
③ 終止液；
④ TMB底物顯色液；
⑤ 病毒標準陽性血清；
⑥ 病毒標準陰性血清；
⑦ 抗原包被酶標板；
⑧ 酶標單克隆抗體。
 
三、實驗步驟
1、將所有試劑從冰箱取出，平衡至室溫；取出20倍濃縮洗滌液充分混懸，確認析出的鹽類完全溶解后，用去離子水按1:20比例稀釋備用。提前調(diào)試Pipetty電動移液器，根據(jù)實驗設計，利用其自動記憶功能預設3-4組常用分液程序，后續(xù)可一鍵切換，減少操作中的參數(shù)設置時長。
 
2、取出包被病毒抗原的酶標板，使用Pipetty電動移液器的連續(xù)分液功能，向每孔精準加入40μL樣品稀釋緩沖液；更換吸頭，向樣品孔加入10μL制備好的待檢血清；更換吸頭，同步向2個陽性對照孔、2個陰性對照孔分別加入10μL陽性血清、陰性血清；更換吸頭，最后向2個空白對照孔各加入50μL樣品稀釋緩沖液。
3、用樣品稀釋緩沖液將酶標單克隆抗體稀釋至工作濃度，使用連續(xù)分液功能，每孔加入50μL，輕輕振蕩酶標板，使血清與酶標單克隆抗體反應液充分混勻，37C孵育60min。
 
4、取出酶標板，迅速甩出酶標板內(nèi)的溶液至含有滅活劑的廢液缸中。每孔加入300μL洗滌液，迅速翻轉(zhuǎn)酶標板將孔內(nèi)洗滌液甩至盛有滅活劑的廢液缸中，將酶標板倒置在干凈的吸水紙上，拍干。洗滌3次~5次。
5、使用連續(xù)分液功能，每孔加入l00μL TMB底物顯色液，37C孵育10min。
 
6、每孔加入50μL終止液。
7、加入終止液后，于450nm波長下，讀取每孔的OD值。
8、血清阻斷率的計算見公式(1):
PI=(1-S/N)x100%......................(1)
式中:
PI 血清阻斷率;
S 陽性對照或陰性對照或待檢樣品的OD值;
N 空白對照OD平均值。
 
四、結(jié)果判定
1、當空白對照孔0.8≤OD值≤1.5、陽性對照孔PI>80%、陰性對照孔PI≤30%時，判為試驗成立，否則重新進行試驗。
2、當被檢牛血清樣品的PI＞38%時，判定為血清抗體陽性；當被檢羊血清樣品的PI＞35%時，判定為血清抗體陽性。當被檢牛血清樣品的PI≤38%時，判定為血清抗體陰性;被檢羊血清樣品的PI≤35%時，判定為血清抗體陰性。