Pipetty 電動移液器在牛羊副流感病毒檢測中的應用
方案摘要：本方案針對MDBK 單層細胞制備、病毒接種及培養(yǎng)物傳代流程進行優(yōu)化，通過引入 Pipetty 電動移液器，提升移液操作的精準性、重復性與效率，降低人工誤差對實驗結(jié)果的干擾，尤其適用于病毒滴度檢測、臨床樣品病毒分離等對移液精度要求高的場景
方案詳情：
一、實驗原理
基于病毒對 MDBK 細胞的特異性感染性，將樣品上清或血清接種至敏感 MDBK 單層細胞，在適宜培養(yǎng)條件下，病毒侵入細胞并增殖，引發(fā)細胞病變效應。通過盲傳3代富集病毒，排除雜菌干擾，結(jié)合陽性對照與陰性對照的 CPE 對比，初步篩選病毒陽性樣品。后續(xù)可通過血清學或分子生物學方法驗證病毒種類。實驗中精準移液是確保病毒分離效率與鑒定準確性的關鍵。
二、實驗準備
1、試劑和耗材
① 離心管(0.5mL、1.5mL、2mL、10mL、50mL等不同規(guī)格)；
② 10mL一次性移液管；
③ 25cm2細胞培養(yǎng)瓶；
④ 0.5%胰酶消化液；
⑤ 0.45um濾器；
⑥ PBS；
⑦ 細胞培養(yǎng)液與細胞維持液；
⑧ BPIV3或CPIV3毒株；
⑨ MDBK細胞。
2、儀器和設備
① Pipetty Pro電動移液器，MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② CO2恒溫培養(yǎng)箱；
③ 臺式離心機；
④ 高速臺式冷凍離心機；
⑤ 旋渦混合振蕩器；
⑥ 組織研磨儀；
⑦ 細胞計數(shù)儀；
⑧ 冰箱(2C~8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)；
⑨ 生物安全柜；
⑩ 倒置顯微鏡。
三、實驗步驟
1、取處于對數(shù)生長期的 MDBK 傳代細胞，棄去舊培養(yǎng)液，加入適量 0.5% 胰酶消化液，室溫消化至細胞變圓脫落。加入細胞培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打瓶壁細胞形成單細胞懸液。
取少量細胞懸液，使用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)。使用Pipetty 電動移液器，精準吸取細胞懸液與培養(yǎng)液，將細胞濃度稀釋至 1×10⁵~2×10⁵ 個 /mL。將稀釋后的細胞懸液分裝至細胞培養(yǎng)瓶，置于 37℃、5%CO₂ 恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 24h，待細胞形成 90%~95% 致密單層后，備用。
2、每瓶(25cm2)MDBK單層細胞在接毒前，先棄去細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用10mLPBS清洗細胞3次，單次移液模式，加入200μL上清液或血清，再加入細胞維持液5mL;同時，設正常細胞對照1瓶和接種BPIV3或CPIV3陽性對照1瓶(接毒量為105TCID50);37C孵育1h后棄上清，補加細胞維持液5mL/瓶；置于37C、5%CO2。恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60h~72h，逐日觀察細胞狀態(tài)，待陽性對照瓶出現(xiàn)100%CPE時，收獲細胞培養(yǎng)物。
3、將收獲的細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，3000r/min離心10min，取上清液，盲傳至第3代，逐日觀察記錄CPE變化。如果正常細胞對照單層完好，形態(tài)正常，接種樣品的細胞80%以上出現(xiàn)拉網(wǎng)狀時，判為典型CPE。將具有典型CPE的細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，收獲病毒懸液，于-70℃以下凍存?zhèn)溆谩?br />
四、結(jié)果判定
1、接種樣品細胞未出現(xiàn) CPE，判定為病毒分離鑒定陰性。接種樣品細胞出現(xiàn)典型 CPE 時，檢測陽性的判定為病毒分離鑒定陽性，檢測陰性的判定為病毒分離鑒定陰性。
方案詳情：
一、實驗原理
基于病毒對 MDBK 細胞的特異性感染性，將樣品上清或血清接種至敏感 MDBK 單層細胞，在適宜培養(yǎng)條件下，病毒侵入細胞并增殖，引發(fā)細胞病變效應。通過盲傳3代富集病毒，排除雜菌干擾，結(jié)合陽性對照與陰性對照的 CPE 對比，初步篩選病毒陽性樣品。后續(xù)可通過血清學或分子生物學方法驗證病毒種類。實驗中精準移液是確保病毒分離效率與鑒定準確性的關鍵。
二、實驗準備
1、試劑和耗材
① 離心管(0.5mL、1.5mL、2mL、10mL、50mL等不同規(guī)格)；
② 10mL一次性移液管；
③ 25cm2細胞培養(yǎng)瓶；
④ 0.5%胰酶消化液；
⑤ 0.45um濾器；
⑥ PBS；
⑦ 細胞培養(yǎng)液與細胞維持液；
⑧ BPIV3或CPIV3毒株；
⑨ MDBK細胞。
2、儀器和設備
① Pipetty Pro電動移液器，MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② CO2恒溫培養(yǎng)箱；
③ 臺式離心機；
④ 高速臺式冷凍離心機；
⑤ 旋渦混合振蕩器；
⑥ 組織研磨儀；
⑦ 細胞計數(shù)儀；
⑧ 冰箱(2C~8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)；
⑨ 生物安全柜；
⑩ 倒置顯微鏡。
三、實驗步驟
1、取處于對數(shù)生長期的 MDBK 傳代細胞，棄去舊培養(yǎng)液，加入適量 0.5% 胰酶消化液，室溫消化至細胞變圓脫落。加入細胞培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打瓶壁細胞形成單細胞懸液。
取少量細胞懸液，使用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)。使用Pipetty 電動移液器，精準吸取細胞懸液與培養(yǎng)液，將細胞濃度稀釋至 1×10⁵~2×10⁵ 個 /mL。將稀釋后的細胞懸液分裝至細胞培養(yǎng)瓶，置于 37℃、5%CO₂ 恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 24h，待細胞形成 90%~95% 致密單層后，備用。
2、每瓶(25cm2)MDBK單層細胞在接毒前，先棄去細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用10mLPBS清洗細胞3次，單次移液模式，加入200μL上清液或血清，再加入細胞維持液5mL;同時，設正常細胞對照1瓶和接種BPIV3或CPIV3陽性對照1瓶(接毒量為105TCID50);37C孵育1h后棄上清，補加細胞維持液5mL/瓶；置于37C、5%CO2。恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60h~72h，逐日觀察細胞狀態(tài)，待陽性對照瓶出現(xiàn)100%CPE時，收獲細胞培養(yǎng)物。
3、將收獲的細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，3000r/min離心10min，取上清液，盲傳至第3代，逐日觀察記錄CPE變化。如果正常細胞對照單層完好，形態(tài)正常，接種樣品的細胞80%以上出現(xiàn)拉網(wǎng)狀時，判為典型CPE。將具有典型CPE的細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，收獲病毒懸液，于-70℃以下凍存?zhèn)溆谩?br />
四、結(jié)果判定
1、接種樣品細胞未出現(xiàn) CPE，判定為病毒分離鑒定陰性。接種樣品細胞出現(xiàn)典型 CPE 時，檢測陽性的判定為病毒分離鑒定陽性，檢測陰性的判定為病毒分離鑒定陰性。
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